旱地棉(Gossypium aridum)耐鹽相關WRKY轉錄因子的全基因組鑒定、克隆及功能分析.pdf

1、為了適應不良的生長環(huán)境，植物在長期的進化過程中形成了一系列復雜而有效的應對機制?，F(xiàn)有的研究表明，這種由于自身進化而獲得的應對機制主要是通過轉錄激活或轉錄抑制相關的基因的表達發(fā)生作用的。而在這一過程中，轉錄因子發(fā)揮著重要的作用，通過與其他相關蛋白或自身之間的相互作用激活或抑制相關靶基因的表達。近年來，研究顯示W(wǎng)RKY轉錄因子家族中眾多成員都參與植物的非生物脅迫響應機制。目前已經(jīng)成為植物抗性功能研究中的一個熱點。但關于棉花，由于基因組大而復

2、雜，轉錄因子家族成員眾多，導致目前的研究還僅限于生物信息學分析、功能結構域的預測分析等方面。對于單個基因的結構、生理生化功能、靶基因及其鹽脅迫下的調(diào)控網(wǎng)絡還很不清楚。本研究利用耐鹽堿棉屬二倍體野生種旱地棉，開展全基因組范圍耐鹽相關WRKY轉錄因子的篩選、鑒定及功能分析，是一種有意義的創(chuàng)新性探索。
　　主要研究如下:
　　1.利用生物信息學技術從本實驗室建立的棉屬野生種旱地棉的轉錄組數(shù)據(jù)庫中共獲得了109個WRKY類基因。對旱

3、地棉的109個GarWRKY基因的126個WRKY結構域構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分類，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類有17個基因，第Ⅱ類有80個基因，第Ⅲ類僅有12個基因。這109個WRKY基因廣泛分布于棉花的13條染色體上，且絕大多數(shù)集中分布于染色體兩端。
　　2.基于鹽脅迫下旱地棉根和葉的表達譜分析，共篩選和克隆了28個鹽脅迫相關GarWRKY基因，提交GenBank，獲得登錄號為KM438453-KM438480。這些基因的ORF長度范圍從474bp

4、到1848bp，平均長度為1048bp，編碼的蛋白由157到615個氨基酸組成，平均長度為348個氨基酸。經(jīng)在線軟件亞細胞定位預測全部定位為細胞核。28個WRKY基因在旱地棉的根、莖、葉、花瓣、雄蕊和花萼組織表達特性分析表明WRKY基因并非在所檢測的組織中均有表達，有27個GarWRKY基因在根中表達，而只有6個基因在檢測的所有組織中都有表達。
　　3.QRT-PCR結果顯示，絕大多數(shù)GarWRKY基因在遭受鹽脅迫1小時后就會被激

5、活，在12或24小時時表達達到頂峰，然后在最后一個處理時間點(72h)回落到基礎水平。然而，在葉中，絕大多數(shù)GarWRKY基因是遭受鹽脅迫6時后才會被激活，在最后一個處理時間點(72h)表達達到頂峰。鹽脅迫下WRKY基因表達分析顯示絕大多數(shù)基因在葉中比根中感應鹽脅迫要有所延遲
　　4.根據(jù)基因表達分析結果，將GarWRKY5（鹽脅迫后上調(diào)），GarWRKY17（鹽脅迫后上調(diào)）和GarWRKY22（鹽脅迫后下調(diào)）三個基因克隆到pCA

6、MBIA2301植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的浸花法成功獲得了轉基因擬南芥株系。T3代轉基因擬南芥表型及生理生化物質分析結果表明，過表達GarWRKY5和GarWRKY17能夠增強轉基因擬南芥對高鹽脅迫的耐受能力，而過表達GarWRKY22卻加劇了轉基因擬南芥對高鹽脅迫的敏感性。VIGS分析表明缺失GarWRKY5和GarWRKY17基因的棉花突變體植株較對照組在鹽脅迫下表現(xiàn)出更嚴重的鹽害反應，而與對照相比，GarWRKY22缺失突變體

7、沒有顯著差異表型。
　　5.對鹽脅迫下過表達GarWRKY17的轉基因擬南芥進行了轉錄組測序，利用數(shù)字表達譜分析法以及生物信息學獲得了11個GarWRKY17在棉花中的下游耐鹽相關靶基因，利用RT-PCR分析了這些基因鹽脅迫下的表達模式，最終闡明了GarWRKY17在鹽脅迫下調(diào)控其下游靶基因的復雜的調(diào)控網(wǎng)絡途徑，主要為(1)激活NRT1.8（NO3-轉運體）的表達，一方面將植物細胞內(nèi)的NO3-轉運到液泡中，通過調(diào)節(jié)離子的平衡來增加

8、植株的耐鹽力，另一方面促進植物細胞對外界氮元素的吸收，通過NRT使氮素通過氨基酸代謝途徑以及次級代謝合成途徑合成一些有機滲透物質進行滲透調(diào)節(jié)，從而增加植物的耐鹽力;(2)激活Ca2+-transporting ATPase的活性，參與SOS途徑后通過Na+/K+離子轉運的反向離子轉運體將體內(nèi)多余的Na+排出體外，維持細胞內(nèi)的離子平衡，使植物免受鹽離子毒害而正常生長;(3)正常條件下，MYB102以及NAC3和WRKY17相結合抑制WRK

9、Y17的表達從而抑制植物的耐鹽力，當植物受到鹽脅迫后，激活了編碼MYB102和NAC3轉錄因子的鑲嵌阻遏蛋白基因的表達，導致鑲嵌阻遇蛋白大量積累，從而抑制了MYB102以及NAC3和WRKY17之間的相互作用，進而激活下游DREB類和ZAT耐鹽相關基因從而提高植物的耐鹽能力;(4)鹽脅迫增強GarWRKY17和GarWRKY28的相互作用，通過兩者的這種組合調(diào)控增強植物對鹽脅迫的應答反應的能力，從而提高植物對鹽的耐受性。
　　6.

10、對鹽脅迫下過表達GarWRKY22的轉基因擬南芥進行了DGE分析，利用數(shù)字表達譜分析法，生物信息學以及RT-PCR獲得了14個GarWRKY22在棉花中的下游耐鹽相關靶基因，并最終預測了GarWRKY22在鹽脅迫可能的調(diào)控網(wǎng)絡途徑，主要為(1)通過氨基酸代謝途徑以及次級代謝合成途徑合成一些有機滲透物質進行滲透調(diào)節(jié);(2)通過調(diào)控光合作用途徑中的電子轉運體以及相關酶類的活性來參與植物的鹽脅迫響應機制;(3)通過調(diào)控參與植物激素信號轉導途徑