建立成人腎臟條件永生化足細胞株的初步研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者致死、致殘的主要原因之一。其臨床特點為尿蛋白排泄率逐年增加、腎功能逐漸減退至終術期腎病。既往研究認為,DN的主要病理特征是腎小球細胞外基質堆積、系膜細胞增多、基底膜增厚,腎小球硬化及腎間質纖維化。然而,腎活檢示伴大量蛋白尿的1型和2型糖尿病患者均有腎小球足細胞密度和數(shù)量減少、剩余足細胞胞體及核體積增大、足突增寬等改變,而且

2、尿白蛋白排泄率與足細胞密度呈反相關,正常蛋白尿或伴微量白蛋白尿的患者足細胞數(shù)量正常。另外,與系膜細胞不同,足細胞是一種高度分化細胞,分裂增殖能力有限,一旦損傷丟失,很難再生。因此,足細胞損傷在糖尿病腎病中的作用逐漸上升,越來越多的學者致力于足細胞的體內、體外研究。
　　 現(xiàn)行主要的足細胞體外培養(yǎng)方法基于Krakower和Greenspon的基礎研究和Burlington和Cronkite的改良。簡要的說,是在無菌條件下,通過一系

3、列不銹鋼篩網(wǎng)的篩查(篩分法),篩網(wǎng)篩孔由250um到150um,最終在75um的篩網(wǎng)上收集得到大鼠腎小球。后經過一些學者的逐步改進,人和嚙齒類腎臟足細胞的原代培養(yǎng)技術基本成熟,還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時出現(xiàn)的兩種形態(tài)細胞——鵝卵石樣細胞和樹枝狀分叉細胞是同一種細胞,兩者只是分化程度的差別,且前者可向后者轉化。
　　 足細胞是一種高度分化細胞,體外培養(yǎng)出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,很難長期培養(yǎng),收集到細胞數(shù)量也有限。為此,Mundel和Jat等發(fā)展了轉基因小

4、鼠,來提取永生化足細胞株,細胞在10％培養(yǎng)基33℃培養(yǎng),并添加INF-γ使其終濃度為100U/ml(許可條件),此時細胞具有無限增殖能力;當移至37℃培養(yǎng),培養(yǎng)基中不含INF-γ(非許可條件)時細胞6-14天之內生長停滯并分化。這個細胞株的建立使小鼠足細胞的研究取得了爆炸性進展。
　　 人類永生化足細胞株的構建相較于嚙齒類動物就落后很多,只有Delarue等建立的有限永生化足細胞株和Saleem等建立的條件永生化足細胞株。雖然證

5、明在許可條件下細胞具有50代以上的增殖活性,非許可條件下可分化并表達足細胞的特異性標志蛋白,但是這兩種細胞株都來源于嬰兒或兒章腎臟,與成人的成熟足細胞表型存在差異,不能較好的代表腎臟的生理學和病理學狀態(tài),而且這兩種細胞株成本高,很難重復,無法廣泛使用。
　　 基于國內足細胞原代培養(yǎng)技術進展緩慢,人腎臟永生化足細胞株空白的現(xiàn)狀,本研究充分考察國際上足細胞體外培養(yǎng)方法,進行成人腎臟條件永生化足細胞株的初步研究,為建立細胞株做好充分準

6、備,進一步為人腎臟足細胞的體外研究提供一個簡便可行的平臺,并為糖尿病腎病的治療尋找新的可行方法。
　　 第一章:成人腎臟足細胞的原代培養(yǎng)及鑒定目的:建立一種重復性好、操作簡便的成人腎臟足細胞原代培養(yǎng)方法.方法:腎臟單極腫瘤患者行腎切除術時,取切除組織的正常腎皮質,通過差異
　　 篩選法分別通過80、40、120目細胞篩網(wǎng),收集120目篩網(wǎng)上腎小球進行接種,利用植塊法將接種培養(yǎng)面向上放置,4h后將培養(yǎng)瓶翻轉過來添加培養(yǎng)基正

7、常放置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行孵育。采用形態(tài)學觀察和細胞間接免疫熒光染色法,對足細胞進行鑒定,并用流式細胞儀分析足細胞純度。
　　 結果:3d后可見絕大部分腎小球貼壁,5d后幾乎全部腎小球貼壁,少許腎小球周圍有細胞爬出,7～8d可見所有腎小球周圍大量細胞爬出,胰蛋白酶差異消化后傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)出的細胞形態(tài)學符合足細胞特征,足細胞特異性蛋白WT-1、nephrin陽性,內皮細胞特異因子F8蛋白陰性。流式細胞儀分析

8、足細胞純度大于98%。
　　 結論:差異過篩法分離人腎小球,結合植塊法促進腎小球貼壁,可簡單、高效地培養(yǎng)出原代足細胞,具備足細胞生物學特征,且在操作簡單的情況下細胞產量、純度與國外文獻報道相當。
　　 第二章:溫度敏感Sv40大T抗原逆轉錄病毒載體系統(tǒng)的建立
　　 目的:構建溫度敏感SV40大T抗原逆轉錄病毒載體pLXSN-tsA58和包裝細胞株,并研究其在包裝細胞PA317中的表達。
　　 方法:從首都

9、醫(yī)科大學生物學系獲贈重組溫度敏感逆轉錄病毒載體質粒pLXSN-tsA58,其構建方法是將pBR3222-SV40 tsA58經KpnⅠ酶切后,再用BamHⅠ和NcoⅠ酶切,回收目的片段進行末端補平。逆轉錄病毒載體pLXSN經EcoRI酶切并對線性化載體進行脫磷酸化處理后,與SV40 tsA58目的片段連接。我們轉化擴增pLXSN-tsA58,酶切鑒定,測序證實。用脂質體轉染試劑介導pLXSN-tsA58轉染入逆轉錄病毒包裝細胞PA317

10、中,經G418篩選后,挑取單克隆擴大培養(yǎng),收集病毒上清液,并用NIH3T3細胞測定病毒滴度,獲得高滴度的抗性克隆,命名為PA317/tsA58。
　　 結果:將pLXSN-tsA58轉化擴增后酶切鑒定出現(xiàn)與預期相符的5個片段,進一步測序證實SV40tsA58基因存在,且擴增得到高濃度質粒。脂質體轉染后篩選出PA317/tsA58細胞抗性克隆,PCR鑒定SV40tsA58基因整合在克隆細胞基因組中,免疫細胞化學鑒定克隆細胞SV40

11、tsA58蛋白表達。收集病毒上清液,滴度達105CFU/ml。
　　 結論:成功構建溫度敏感SV40大T抗原逆轉錄病毒載體pLXSN-tsA58,建立的包裝細胞系PA317/tsA58能穩(wěn)定產生高滴度病毒顆粒,為下一步感染成人腎臟足細胞奠定了基礎。
　　 結論:
　　 1.通過差異過篩法分離成人腎小球,結合植塊法促進腎小球貼壁,簡單、高效地培養(yǎng)出原代足細胞。
　　 2.培養(yǎng)出的足細胞具備成人足細胞生物學特