微生物轉化去氫表雄酮生產甾體藥物中間體的研究.pdf

1、去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是一種C19腎上腺甾類化合物,主要具有抗癌、延緩衰老及免疫調節(jié)等作用。DHEA可由來源豐富價格低廉的薯蕷皂苷元為原料經簡單的化學合成法而得到,而且由去氫表雄酮作為中間體能合成許多有重要生理活性的甾體類藥物,如7α-OH-DHEA的抗氧化活性及抗腫瘤作用均較顯著,1α-OH-DHEA是用于合成活性維生素D3及其類似物的一個重要的藥物中間體。
　　本文利用微生物轉化的

2、方法對去氫表雄酮進行羥基化結構修飾。通過平板透明圈初篩和TLC復篩,從實驗室保藏的菌種中篩選到一株對去氫表雄酮(DHEA)轉化能力較強的菌株,經形態(tài)學觀察和16s rDNA分析鑒定,確定該菌為白色鏈霉菌。進一步通過20L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)富集轉化產物,經硅膠柱層析、分子篩柱層析及高效液相制備柱等方法對轉化產物進行分離純化得到三種化合物,進一步利用核磁波譜分析、質譜及旋光性測定確定其化學結構,分別為7α-OH-DHEA,7β-OH-DHEA及

3、1α-OH-DHEA。
　　隨后對白色鏈霉菌轉化DHEA過程中發(fā)酵培養(yǎng)基和轉化條件進行了優(yōu)化,通過單因素實驗和正交實驗確定了轉化培養(yǎng)基中最優(yōu)碳源、氮源及無機鹽,分別為葡萄糖20g/L,酵母膏5g/L,硫酸銨8g/L,磷酸氫二鉀0.75g/L。最優(yōu)轉化條件如下:最適培養(yǎng)溫度為30℃,搖床轉速為160r/min,培養(yǎng)基初始pH為7.0,菌株斜面培養(yǎng)5d后制備孢子懸液,孢子懸液最佳接種量即發(fā)酵液終濃度為1×106個/mL,接種后48h添

4、加底物DHEA,底物添加方式為β-環(huán)糊精包埋,底物添加量為1mg/mL,轉化時間為加入底物后繼續(xù)轉化培養(yǎng)48h。綜合以上各優(yōu)化條件,單位菌體的總產物轉化率達到37.96％,比條件優(yōu)化前提高了15.2％。
　　最后對白色鏈霉菌高效轉化DHEA的機理進行了初步研究,利用CO還原差示光譜法測定細胞內微粒體P450的含量,分析了菌體對甾體底物DHEA轉化過程中P450酶的變化情況,研究了P450酶的幾種誘導劑(苯甲酸、正己烷和鄰苯二甲酸異