線粒體在膿毒癥淋巴細胞凋亡作用機制的研究.pdf

1、目的：目前的研究發(fā)現(xiàn)大量，迅速的淋巴細胞凋亡是造成膿毒癥免疫抑制的關鍵環(huán)節(jié)，也是影響預后的重要參數(shù)。在動物細胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡機制和細胞凋亡核心。本實驗采用盲腸結扎穿孔的方法復制小鼠膿毒癥動物模型，觀察膿毒癥時小鼠脾臟淋巴細胞凋亡的情況，檢測線粒體膜電位及細胞色素C在線粒體和胞漿內含量的變化，研究線粒體在膿毒癥淋巴細胞凋亡的作用機制。 方法：用雌性、6～8周、C57BL/6小鼠建立盲腸結扎穿孔(CLP)的膿毒癥動物模

2、型。將實驗動物隨機分為兩組：對照組、CLP組。觀察動物的一般情況及生存率變化。取肺臟、肝臟、脾臟、小腸行病理學檢查，確證模型；分離脾淋巴細胞，采用AnnexinV-FITC/PI標記，流式細胞儀檢測脾淋巴細胞的凋亡變化；羅丹明123標記，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化；分離脾淋巴細胞線粒體和胞漿組分，Western-blot檢測細胞色素C在線粒體、胞漿中的含量變化。 結果：1)膿毒癥動物模型的確認兩組實驗動物均術后很快蘇醒，對

3、照組無明顯異常反應，且全部存活。CLP術后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應遲鈍、活動差、怕冷、聚居、豎毛、厭食、眼角分泌物增多等表現(xiàn)。CLP組小鼠的多臟器病理切片可見組織細胞結構改變和不同程度的炎細胞浸潤，如肺泡腔內見炎性滲出物及脫落的肺泡上皮、肝細胞灶性壞死伴炎細胞浸潤、脾臟白髓淋巴濾泡內大量呈灶性分布的淋巴細胞凋亡、小腸漿膜面出現(xiàn)大量的膿性滲出物。而對照組多臟器病理切片不見或少見異常。CLP組小鼠，24小時存活率達到80％左右，72h存

4、活率為45％～55％，符合膿毒癥動物模型標準。2)脾淋巴細胞凋亡的檢測利用AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞儀檢測小鼠脾淋巴細胞的凋亡變化，發(fā)現(xiàn)對照組脾淋巴細胞凋亡比例為(3.52±0.25)％，CLP組脾淋巴細胞的凋亡比例增高到(17.32±2.24)％，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。證實膿毒癥模型存在明顯的淋巴細胞凋亡。3)線粒體膜電位的檢測利用陽離子綠色熒光染料羅丹明123檢測線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)CLP組線粒體膜

5、電位沒有降低的細胞比例下降到(76.23±1.56)％，明顯較對照組(99.62±0.37)％減少，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果說明在膿毒癥模型中，淋巴細胞凋亡時線粒體功能變化，起重要作用的線粒體膜電位明顯降低。4)細胞色素C的檢測通過Western-blot檢測，從圖片可直觀地看到對照組線粒體內的細胞色素C呈強陽性表現(xiàn)，而CLP組線粒體內的細胞色素C呈弱陽性表現(xiàn)。對照組胞漿中的細胞色素C極少量，可視為陰性，而CLP組胞漿中的

6、細胞色素C呈強陽性表現(xiàn)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出CLP組脾淋巴細胞線粒體和胞漿內的細胞色素C含量與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。證實膿毒癥時脾淋巴細胞線粒體內的細胞色素C釋放到胞漿中。 結論：1)依照文獻報道建立的盲腸結扎穿孔模型，經(jīng)過術后的一般情況和生存率變化，以及多臟器病理切片結果的驗證，符合膿毒癥模型標準，可用于進一步的實驗研究。2)通過AnnexinV/PI染色流式細胞儀檢測，結果顯示在這個CLP膿

7、毒癥模型中可測到脾淋巴細胞大量凋亡。證實了膿毒癥時存在淋巴細胞大量凋亡。淋巴細胞大量凋亡可通過造成免疫細胞無反應性或抗炎細胞因子的分泌等抑制機體免疫防御功能，從而加重膿毒癥的病情變化。3)應用羅丹明123標記，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型中脾淋巴細胞線粒體的膜電位明顯降低；Western-blot檢測到膿毒癥模型脾淋巴細胞線粒體內的細胞色素C釋放到胞漿中，誘導凋亡。上述結果表明在膿毒癥中脾淋巴細胞線粒體功能發(fā)生明顯