Nrf2在膿毒癥T淋巴細胞鐵死亡中的作用研究.pdf

1、目的:本課題的研究目的為通過盲腸結扎穿孔法(CLP法)建立小鼠膿毒癥模型，檢測T淋巴細胞內鐵死亡重要指標隨膿毒癥嚴重程度的變化情況，研究T淋巴細胞鐵死亡與膿毒癥的關系及Nrf2在膿毒癥T淋巴細胞鐵死亡中的作用。
　　方法:雄性C57BL/6j小鼠共計51只，分為:生存分析組、假手術（對照）組、輕度膿毒癥組、重度膿毒癥組。生存分析組繼續(xù)分為假手術亞組、輕度膿毒癥亞組、重度膿毒癥亞組，觀察各時間點小鼠的表現(xiàn)及生存情況。假手術組小鼠在中

2、下腹部腹中線做切口，暴露腹腔，找到盲腸后不做處理立即將盲腸回納腹腔，關腹縫合。輕度膿毒癥組、重度膿毒癥組分別在找到盲腸后在距離盲腸遠端1/3和2/3交接點處結扎盲腸和部分血管，再用27G針頭貫穿扎孔3次后回納腹腔，關腹縫合。48h后留取小鼠的全血、腹腔灌洗液、脾臟、肺泡灌洗液、肺組織等標本。分別用比色法和考馬斯亮藍法測定肺灌洗液中白蛋白和總蛋白含量，二者相比計算肺通透指數(shù)(LPI)，觀察小鼠有無急性肺損傷發(fā)生，并測定肺組織中Nrf2的表

3、達水平。檢測小鼠腹腔灌洗液和血清中鐵離子、轉鐵蛋白、鐵蛋白的表達水平。檢測小鼠外周血及腹腔灌洗液中T淋巴細胞數(shù)目;RT-PCR檢測各組小鼠T淋巴細胞中caspase3、caspase4、caspase8、caspase9、caspase12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表達情況;測定各組小鼠T淋巴細胞中ROS、GSH含量;RT-PCR和Western blot法檢測各組小鼠T淋巴細胞中Nrf2的表達情況并對比分析;流式細胞儀

4、測定各T淋巴細胞亞群凋亡比例。
　　結果:
　　(1)根據各亞組小鼠的生存情況用SPSS軟件進行生存分析，結果可見小鼠死亡率隨著膿毒癥加重而明顯增加。
　　(2)測定肺通透指數(shù)(LPI)，結果示輕度膿毒癥組肺通透指數(shù)與假手術組相比無顯著差異，但重度膿毒癥時肺通透指數(shù)升高，出現(xiàn)急性肺損傷。說明膿毒癥模型構建成功。
　　(3)測定肺組織中Nrf2的表達水平:
　　WB檢測肺組織中Nrf2蛋白及其磷酸化水平表達情

5、況，結果示輕度膿毒癥組中的表達量較假手術組略有降低，而重度膿毒癥組中的表達量較假手術組明顯升高。磷酸化的Nrf2在各動物間表達差異較大，但重度膿毒癥組中的表達量較假手術組還是有所升高。
　　RT-PCR檢測Nrf2在mRNA水平表達情況，結果示Nrf2的mRNA表達水平在輕度膿毒癥組小鼠中略有升高，且在重度膿毒癥組小鼠中顯著升高。
　　(4)檢測小鼠腹腔灌洗液中鐵離子、轉鐵蛋白、鐵蛋白含量，結果顯示:重度膿毒癥組小鼠腹腔灌洗

6、液中的鐵離子、鐵蛋白、轉鐵蛋白含量較假手術組均有所升高。
　　(5)檢測小鼠血清中鐵離子、轉鐵蛋白、鐵蛋白含量，結果顯示:重度膿毒癥組小鼠血清中鐵離子的含量較假手術組顯著降低，而血清中鐵蛋白和轉鐵蛋白的含量較假手術組均有顯著升高。
　　(6)檢測CLP建模后小鼠脾臟中各T淋巴細胞亞群數(shù)目變化，結果顯示:重度膿毒癥組小鼠脾臟中CD3、CD4、CD8的陽性率較假手術組均有顯著下降。
　　(7)驗證T淋巴細胞死亡是否為鐵死亡

7、:
　　RT-PCR檢測各組小鼠T淋巴細胞中caspase3、caspase4、caspase8、caspase9、caspase12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表達，結果可見各基因在輕度膿毒癥組中的表達均略有升高，而在重度膿毒癥組中除caspase12外，其余各基因的表達均與假手術組和輕度膿毒癥組相比升高顯著，caspase12雖也有升高，但各組間差異較大。
　　輕度膿毒癥組小鼠T淋巴細胞中的ROS含量較假手

8、術組略有升高，重度膿毒癥組小鼠T淋巴細胞中的ROS含量較假手術組顯著升高。輕度膿毒癥組和重度膿毒癥組小鼠T淋巴細胞中的GSH含量較假手術組均顯著降低。
　　Western blot檢測各組小鼠T淋巴細胞中Nrf2的表達情況時，Nrf2和p-Nrf2無法得到合適條帶。RT-PCR檢測結果示:輕度膿毒癥組小鼠T淋巴細胞中Nrf2的表達量較假手術組略有升高，重度膿毒癥組小鼠Nrf2表達量較假手術組顯著升高。
　　用流式細胞術檢測各