茉莉酸甲酯對人涎腺腺樣囊性癌細胞生長抑制作用及其機制的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma，SACC)是較為常見的涎腺惡性腫瘤之一，好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體，約占涎腺上皮性腫瘤的11％，約占涎腺惡性腫瘤的27％?？砂l(fā)生于任何年齡，以40～60歲居多，無明顯性別差異。SACC生長緩慢，侵襲性強，容易向神經(jīng)、血管和骨呈浸潤和破壞性生長，術后常有復發(fā)。SACC區(qū)域淋巴結轉移少見，可發(fā)生肺、骨、腦和肝等遠處轉移，致患者術后

2、生存率低，預后較差。因此，尋找針對SACC的新療法和低毒高效的抗癌藥物勢在必行。
　　植物激素(plant hormone)又稱植物天然激素或植物內源性激素，是一類有機物質，由植物自身代謝產(chǎn)生，自產(chǎn)生部位移動到作用部位，在極低濃度下就可顯示出明顯的生理效應。茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)及其甲酯(MethylJasmonate，Me-Ja)在植物界廣泛存在，已被第16屆（1999年）國際植物生長會議接受為新一類的植物激

3、素，是調節(jié)高等植物發(fā)育、應答外界刺激（尤其是創(chuàng)傷）、調節(jié)基因表達的一類內源性信號分子。近年來的研究表明，JA可致使人淋巴細胞白血病細胞Molt-4株死亡，抑制人乳腺癌MCF-7細胞株、黑色素瘤SK-28細胞株和前列腺癌LNcaP細胞株增殖，而Me-Ja能夠導致以上各種細胞株死亡。Me-Ja還能抑制口腔鱗癌細胞、肝癌細胞、神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長，誘導其發(fā)生凋亡。鑒于不同細胞對其敏感性存在差異，本研究選擇人涎腺腺樣囊性癌ACC-2細胞株進行

4、實驗，觀察Me-Ja對ACC-2細胞的作用，為其治療SACC提供實驗理論依據(jù)。
　　目的:
　　本課題以腺樣囊性癌ACC-2細胞為研究對象，通過體外實驗研究，從細胞和分子水平上觀察Me-Ja對ACC-2細胞株的作用，探討其可能存在的機制，為Me-Ja抗SACC作用的進一步研究提供理論以及實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)ACC-2細胞，運用CCK-8法篩選茉莉酸甲酯的有效作用濃度及增值抑制率測定;倒置顯微鏡

5、觀察各組細胞形態(tài)變化;透射電鏡下觀察各組細胞的超微結構;流式細胞術檢測細胞周期分布。
　　2.應用RT-PCR技術及免疫細胞化學SP法分別檢測各組ACC-2細胞中Bcl-2、BaxmRNA和蛋白的表達強度。
　　3.實驗分組:空白對照組、5-Fu組、Me-Ja組、Me-Ja+5-Fu組。
　　結果:
　　1.CCK-8法檢測各濃度梯度Me-Ja作用不同時間對ACC-2細胞增殖抑制率結果:Me-Ja對ACC-2細胞

6、具有增殖抑制作用，這種作用隨Me-Ja作用濃度的增加、作用時間的延長而增大，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。
　　2.Me-Ja對ACC-2細胞的半數(shù)抑制濃度IC50結果:Me-Ja對ACC-2細胞半數(shù)抑制濃度IC50為9.20μmol/L。后續(xù)試驗Me-Ja濃度采用1/2IC50，即4.6μmol/L。
　　3.倒置顯微鏡下觀察Me-Ja作用后ACC-2細胞的形態(tài)學變化結果:空白對照組:ACC-2細胞貼壁生長，細胞呈梭形、多邊形，異

7、型性明顯。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見部分細胞脫落，貼壁細胞明顯減少。Me-Ja+5-Fu組脫落細胞更多，貼壁細胞數(shù)目較單藥作用組更少。
　　4.CCK-8法檢測各組ACC-2細胞增殖抑制率結果:5-Fu組為44.22％，Me-Ja組為44.92％，Me-Ja+5-Fu組為49.30％。5-Fu與Me-Ja單獨作用組之間相比，P＞0.05，聯(lián)合作用組與單藥作用組相比P＜0.05，說明5-Fu與Me-Ja單獨作用對AC

8、C-2細胞的增值抑制率無明顯差別，聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單獨用藥。
　　5.透射電鏡下觀察各組ACC-2細胞超微結構結果:空白對照組ACC-2細胞幼稚，分化程度低，增殖力強，屬惡性腫瘤細胞的典型特征。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見到部分細胞表面微絨毛消失，細胞之間連接變少甚至消失，部分細胞呈現(xiàn)凋亡改變，聯(lián)合作用組尤其明顯。
　　6.流式細胞術檢測各組ACC-2細胞周期分布結果:空白對照組:ACC-2細胞有40.8％處于

9、G1期，有24.6％處于S期;5-Fu組:有55.9％的細胞處于G1期;17.2％的細胞處于S期;細胞阻滯于G1期;Me-Ja組:62.1％的細胞處于G1期，17.3％的細胞處于S期，細胞也阻滯于G1期;亞二倍體峰出現(xiàn)，說明部分細胞出現(xiàn)凋亡。Me-Ja+5-Fu組:61.2％的細胞處于G1期，僅7.1％的細胞處于S期，細胞G1期阻滯效果更明顯，典型凋亡亞二倍體峰可見，更多細胞出現(xiàn)凋亡。
　　7.RT-PCR法檢測各組ACC-2細胞

10、Bcl-2和BaxmRNA表達結果:Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后，ACC-2細胞內Bcl-2mRNA的表達水平相對空白對照組均明顯下降（P＜0.05)，而BaxmRNA的表達水平相對空白對照組明顯升高（P＜0.05）。
　　8.免疫細胞化學SP法檢測Bcl-2和Bax蛋白結果:Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后，各實驗組ACC-2細胞內Bcl-2蛋白在胞漿中表達水平均明顯低于對