兔骨髓間充質干細胞定向成骨誘導復合異種松質骨修復兔尺骨骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究經(jīng)定向成骨誘導的兔骨髓間充質干細胞復合異種松質骨移植修復兔尺骨骨缺損的能力及特點，為骨組織工程治療骨缺損選擇理想的種子細胞來源及合適的支架材料尋求一種新的方法。
　　方法：
　　先取新生24h內(nèi)新西蘭大白兔顱蓋骨，采用改良酶消化法提取兔成骨細胞(osteoblast，0B);再取2周齡新西蘭大白兔四肢長骨，采用密度梯度離心法提取骨髓間充質干細胞(BMSCs)。通過細胞形態(tài)學觀察、細胞化學染色、MTT法測

2、定細胞增殖等檢測，對兩種原代細胞進行鑒定。
　　取第3代BMSCs和OB，應用Transwell雙層細胞培養(yǎng)板將兩種細胞共同培養(yǎng)，實驗共設三組:A組上室接種OB，B組和C組上室均未接種細胞，B組使用成骨誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)，C組使用BMSCs生長液培養(yǎng)作為空白對照組，三組培養(yǎng)下室均接種BMSCs。通過細胞形態(tài)學觀察、茜素紅染色、BMSCs上清液中堿性磷酸酶和骨鈣素測定，RT-PCR檢測骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達，對誘導后的細胞進

3、行鑒定。
　　取檢疫合格的豬股骨髁部松質骨，經(jīng)處理制成生物型異種松質骨。使用前BMSC生長液浸泡6h，晾干后接種定向成骨誘導的BMSCs，體外培養(yǎng)一周，顯微鏡下觀察成骨誘導的BMSCs在異種松質骨支架上的粘附、生長情況，MTT法測定支架上細胞增殖情況。
　　取6月齡新西蘭大白兔36只，采用完全隨機抽樣的方法，抽取30只新西蘭大白兔每組15只作為實驗組和對照組，其余6只作為空白對照組，隨機選取一側前肢制作尺骨中段15mm節(jié)段性

4、骨缺損模型。按照植入物不同分為三組:實驗組:缺損處植入成骨誘導的BMSCs復合異種松質骨;對照組:缺損處植入異種松質骨;空白對照組:不植入任何材料。于術后4、8、12周3個時間點每組處死5只實驗動物取標本，通過X線檢查、標本大體觀察和骨缺損區(qū)HE組織化學染色，及術后12周兔尺骨缺損區(qū)幾何參數(shù)測量，比較各組骨缺損的修復情況。
　　結果：
　　1.細胞的提取和鑒定:密度梯度離心法提取BMSCs，操作簡單、細胞純度高，得到的細胞呈

5、長梭形;改良酶消化法提取成骨細胞，耗時短、細胞產(chǎn)出率高，得到的細胞呈短梭形或多角形。兩種原代細胞經(jīng)鑒定為骨髓間充質干細胞和成骨細胞。
　　2.BMSCs定向成骨誘導分化:Transwell雙層細胞培養(yǎng)板法和成骨誘導液培養(yǎng)法兩組細胞上清液中AKP、OCN含量在同時間檢測點上檢測結果顯示兩者無明顯差異(P＞0.05)，兩組成骨誘導后的細胞茜素紅染色均為陽性，RT-PCR檢測兩組成骨誘導的細胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表達

6、。
　　3.異種松質骨的制備與成骨誘導的BMSCs復合培養(yǎng):經(jīng)去抗原處理后的異種松質骨，外觀呈白色至淡黃色、疏松多孔狀。接種細胞后顯微鏡下觀察細胞在異種松質骨支架材料上生長良好，MTT法測定結果顯示隨著培養(yǎng)時間增加細胞數(shù)量增多。
　　4.骨缺損修復實驗:X線觀察:術后4、8、12周顯示實驗組骨缺損區(qū)骨痂量明顯多于對照組及空白組。X線評分結果:各組均隨時間延長得分逐漸增多，實驗組與其他各組相比差異均有顯著性意義(P＜0.05）

7、。組織學觀察:術后4、8、12周實驗組形成的編織骨量明顯多于對照組和空白組。術后12周標本幾何參數(shù)測量:實驗組尺骨骨痂中分處的冠狀徑、矢狀徑和骨痂厚度明顯大于對照組和空白組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.密度梯度離心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨細胞是較為優(yōu)良的原代細胞提取方法。
　　2.Transwell雙層細胞培養(yǎng)板法能使BMSCs定向誘導為成骨細胞，但不適合大規(guī)模應用。