骨髓間充質干細胞復合異種骨在兔體內的再血管化和成骨研究.pdf

1、目的： 近年來組織工程學的迅速發(fā)展使得利用其原理和方法再生組織或器官的特點和優(yōu)勢得到廣泛認同。作為組織工程研究的重要領域，骨組織工程研究在多方面均取得了令人振奮的研究成果，并已在臨床得到初步應用，被認為是組織工程中最具有前途和可行性的領域之一。本課題根據(jù)骨組織工程學的基本原理，設計將骨髓間充質干細胞與帶部分松質骨的小牛皮質骨板復合，植入新西蘭大白兔髂骨內觀察其成骨及再血管化情況，為構建理想的初步組織工程骨工程化產品提供理論依據(jù)。

2、 方法： 1.兔骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取新西蘭大白兔骨髓，采用密度梯度離心法并結合傳代獲取、純化細胞，觀察細胞形態(tài)和表面標志物的表達，從而對其鑒定。MTT法測定第3、6代細胞的增殖情況，并繪制出生長曲線。 2.兔骨髓間充質干細胞的誘導成骨研究 取生長良好的傳三代細胞，用成骨誘導培養(yǎng)基進行誘導，觀察細胞形態(tài)，并分別于培養(yǎng)的第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天收集

3、細胞，進行細胞內堿性磷酸酶含量測定；于誘導7天時行I型膠原免疫細胞化學染色，于誘導14天行骨鈣素免疫細胞化學染色，于誘導21天時行鈣化結節(jié)染色；取傳第三代，誘導7天，誘導14天，誘導21天后的的細胞行RT-PCR檢測BMP-2，VEGF的mRNA含量和采用Western-blot檢測BMP-2，VEGF的蛋白含量。 3.兔骨髓間充質干細胞與小牛骨的生物相容性研究 取第三代細胞接種在帶部分松質骨的小牛皮質骨板上，接種后第4

4、、8、12、24小時取樣測定細胞的粘附率；將不同濃度的小牛骨浸提液與兔BMSCs體外培養(yǎng)2d，4d，7d，觀察細胞的形態(tài)變化并用MTT檢測，計算細胞的相對增殖度，用六級毒性分類進行分級；BMSCs與小牛骨復合培養(yǎng)2周后，取材行掃描電鏡觀察細胞在材料表面的生長增殖和基質分泌情況。 4.兔骨髓間充質干細胞復合小牛骨植入兔體內的實驗研究 (1)分別將兔BMSCs成骨誘導后復合的異種骨(I組)，單純異種骨(II組)，自體髂骨(Ⅲ

5、組)隨機植入兔髂骨。觀察各組植入物的表面變化及周圍組織反應。 (2)術后4周，8周，12周，24周行X線片檢查，觀察X線片變化情況。 (3)術后4周，8周，12周，24周取材行HE染色及VEGF，BMP-2免疫組織化學染色觀察表達情況。 (4) RT-PCR檢測體內各組術后4周，8周，12周，24周時VEGF，BMP-2的mRNA的表達情況。 結果： 1.經密度梯度離心結合傳代所得到的細胞形態(tài)均一

6、，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時可呈現(xiàn)旋渦樣生長，傳第10代細胞的增殖能力減弱，出現(xiàn)寬大梭形，排列紊亂。所分離的細胞表達CD44、CD29，僅約5％表達CD34。生長曲線顯示第3、6代細胞均有較強的增殖能力。 2.兔骨髓間充質干細胞成骨誘導后，細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮?，多角形，最后成集落層疊生長；在誘導過程中，ALP含量逐漸增高，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；于誘導7天時I型膠原免疫細胞化學染色，誘導14天骨鈣素免疫

7、細胞化學染色，誘導21天時鈣化結節(jié)染色陽性；RT-PCR和Western-Blot結果顯示誘導組和對照組均有BMP-2和VEGF表達，誘導組于誘導后第7天，兩者表達最強。誘導組于誘導后第7天、第14天和第21天與對照組比較VEGF和BMP2表達有顯著差異(P<0.05)。 3.細胞接種4h，8h，12h，24h，細胞粘附率分別為47±4％，65±2％，77±3％，86±12％。不同濃度的小牛骨浸提液與兔BMSCs體外培養(yǎng)，細胞貼

8、壁生長，形態(tài)良好，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加細胞大量增殖，毒級為0-1級。BMSCs與小牛骨復合培養(yǎng)2周后行掃描電鏡觀察，細胞均在小牛骨表面生長，并可延入材料孔隙之中，有基質分泌。 4.各組材料復合體植入兔髂骨后，傷口生長良好，沒有全身和局部的炎癥和毒性反應，傷口一期愈合。X線顯示髂骨組在術后12周基本達到骨質愈合，復合異種骨組在術后24周時與宿主骨結合部基本愈合，而單純異種骨組術后24周與宿主骨愈合不滿意。術后4周，8周，12周，24

9、周取材行HE染色可觀察到軟骨化骨過程，各時間點VEGF，BMP-2免疫組織化學染色陽性，陽性程度Ⅲ組>I組>II組。術后4、8、12、24周各組均可見BMP2、VEGF的mRNA表達，BMP2在I組、II組、Ⅲ組之間相比，各組相比P<0.05，有統(tǒng)計學意義，即成骨能力：Ⅲ組>I組>II組。VEGF在II組與I組、II組與Ⅲ組之間相比，在各時間點P<0.05，有統(tǒng)計學意義。I組與Ⅲ組在術后8、12、24周時比較P>0.05，無統(tǒng)計學意義。

10、 結論： 1.兔BMSCs分離、提取操作簡便易行，且有較強的生長增殖能力，可誘導分化為成骨細胞，符合組織工程種子細胞的基本條件。其在成骨誘導過程中，BMP-2和VEGF表達均先增強后減弱，VEGF表達可能對血管生成有促進作用。 2.帶部分松質骨的小牛皮質骨可作為骨組織工程中BMSCs的細胞載體，無毒，生物相容性好，基本滿足骨組織工程的需要。體內實驗表明其是一種較為理想的骨組織工程支架材料，在組織相容性、力學性能及