體細胞核移植技術生產(chǎn)克隆豬及轉基因豬程序的研究.pdf

1、體細胞核移植技術已廣泛應用于動物農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域，體細胞克隆包括許多環(huán)節(jié)，影響克隆效率的包括很多重要因素，如受體卵母細胞的去核，以及重構胚的表觀遺傳修飾，另外轉基因與非轉基因細胞作為供體細胞也受到很大的爭議。本實驗嘗試從對化學輔助去核方法（Demecolcine處理）的深入探究，組蛋白去乙?；种苿–UDC-101）對表觀遺傳的修飾及轉基因（IFN-γ，scFv，IS）與非轉基因細胞進行體細胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉基因豬三方面著手，進一步

2、對體細胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉基因豬的操作程序進行研究。
　　實驗一：Demecolcine（DEM）是一種微管破壞劑，在許多物種中已廣泛應用于M II卵母細胞的去核，然而，目前沒有報道探究這種方法對豬卵母細胞中細胞成熟促進因子（MPF）分布的影響。
　?。?）本實驗探究了不同DEM處理時間對豬卵母細胞成熟后MPF活性的影響。DEM處理豬卵母細胞0.5h、1h、2h、3h后MPF活性均高于對照組，在處理1h后MPF活性達到最高

3、值，因此確定1h處理時間為DEME的最佳處理時間。
　　（2）探究了DEM處理對豬卵母細胞去核后MPF及其亞基Cyclin B1的分布影響。我們分析了DEM處理后MPF水平和Cyclin B1在豬卵母細胞中的分布。我們證明了經(jīng)卵母細胞處理0.4μg/ml DEM1h影響了MPF的分布，使MPF的分布發(fā)生改變，集中于細胞質中，從而提高去核后細胞質內MPF濃度，極大限度的保留了MⅡ期卵母細胞MPF活性；免疫熒光染色觀察MPF的調解亞基

4、Cyclin B1，DEM處理組中紡錘體微管被破壞并誘導染色質凝集，Cyclin B1較為均勻的分布于整個卵母細胞內，導致MPF水平升高。
　?。?）比較了化學輔助去核法和機械去核法去核效率及細胞質中MPF含量的比較。分別采用化學輔助去核和機械去核法去除豬卵母細胞細胞核，對去核前后卵母細胞MPF水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)化學輔助去核法對卵母細胞MPF水平未有改變，而機械去核法使MPF水平降低。去核后注入五指山小型豬耳皮細胞，對重構胚進行培

5、養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)化學輔助去核法的去核率及注核后細胞的發(fā)育，囊胚率均高于普通機械去核法，2-4細胞發(fā)育率分別為80.6％、78.8%，囊胚率分別為16.3%、14.1%，差異并不顯著。體內發(fā)育實驗驗證化學輔助去核法優(yōu)于機械去核組。這為理解化學輔助去核方法提供理論根據(jù)。
　　實驗二：體細胞核移植技術生產(chǎn)的克隆動物其成功率低，這與表觀遺傳異常有一定關聯(lián)，這其中就包括組蛋白乙酰化的異常。通過組蛋白去乙?；种苿?，可以改變表觀遺傳狀態(tài)，從而進一步提

6、高體細胞克隆胚胎的發(fā)育潛能。CUDC-101已經(jīng)有研究證明這種去乙酰化抑制劑可以提高組蛋白乙?；?，但是在體細胞克隆胚胎方面至今還未有人使用。本研究是使用CUDC-101探究其對豬體細胞核移植胚胎的影響。利用不同濃度的組蛋白去乙?；种苿?CUDC-101處理豬體細胞克隆胚胎24 h，尋找最適合濃度，隨后用最適濃度處理不同時間。確定好最佳時間和最佳濃度后，將胚胎通過胚胎移植移入代孕母豬體內，觀察其妊娠情況。結果：在體外發(fā)育的胚胎給予不

7、同濃度的CUDC-101處理，觀察各濃度對于胚胎發(fā)育能力的影響。結果顯示，經(jīng)1μM的CUDC-101處理24h的胚胎與對照組以及0.5，10μM處理組相比，其囊胚率明顯提高，分別為18.1%，9.9%，8.1%和0.0%（P<0.05）。用1μM的CUDC-101處理重構胚不同的時間，并在處理后激活胚胎。結果可知，經(jīng)24 h處理的胚胎，囊胚率高于其他組別。對CUDC-101處理的胚胎以及未經(jīng)處理胚胎進行胚胎移植，移植到代孕母豬體內。綜上

8、所述，CUDC-101均可以顯著提高豬SCNT胚胎體內及體外核重編程的發(fā)育能力。
　　實驗三：通過體細胞克隆方法生產(chǎn)轉基因動物已經(jīng)成為一種新方法，在本實驗中，我們評估了通過體細胞核移植生產(chǎn)轉基因豬的效率，供體細胞采自2歲雌性五指山小型豬耳皮細胞，細胞分別轉染三種不同抗病基因，分別為轉染豬γ干擾素（IFN-γ）基因，抗口蹄疫病毒單鏈抗體基因（scFv）、豬IFN-γ及抗口蹄疫病毒scFv融合基因(IS)，與非轉基因細胞比較，作為供體

9、細胞用于體細胞克隆。
　　結果：
　　（1）我們評估了當轉基因細胞與非轉基因細胞分別作為供體時的胚胎的發(fā)育潛能，在卵裂率無顯著差異，分別為78.4%，79.5%，79.7%和80.6%，在隨后囊胚率上也無顯著差異，分別為10.8%，12.0%，11.4%和16.2%。
　?。?）將轉有3種不同基因及非轉基因組的重構胚分別被移植到27頭代孕母豬體內，其中19頭在胚胎移植后24-26天B超檢查中表現(xiàn)為妊娠，最終11頭代孕母

10、豬分娩生產(chǎn)下67頭仔豬，仔豬出生一周后有25頭死亡，最終我們獲得了49頭存活克隆仔豬。經(jīng)比較，轉基因組與非轉基因組在克隆仔豬成活率上并未有顯著性差異，分別為57.1%，52.6%，50.0%和66.6%（P<0.05）。經(jīng)PCR基因分析，6頭表現(xiàn)為轉基因陽性。其中，5頭為scFv基因陽性，1頭為IFN-γ基因陽性。結論， 我們成功生產(chǎn)出轉有IFN-γ和scFv基因的克隆五指山小型豬，與非轉基因克隆豬相比較，在卵裂率、囊胚率及產(chǎn)