豬體細胞核移植及體外受精技術(shù)的研究.pdf

1、本研究對豬卵母細胞體外成熟、孤雌激活、體外受精、供核細胞培養(yǎng)、體細胞核移植及胚胎培養(yǎng)等技術(shù)進行了實驗，并對相關(guān)影響因素做了對比和分析，以此建立豬體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)和體細胞核移植技術(shù)實驗體系，為進一步的轉(zhuǎn)基因豬的研究提供理論和技術(shù)支持。
　　 本研究包括以下主要內(nèi)容：（1）在IVM培養(yǎng)液中添加不同的激素或激素組合、添加不同濃度比例的FSH、LH、必須和/或非必需氨基酸等，研究它們對豬卵母細胞體外成熟的影響。（2）在不同成熟培養(yǎng)體系中

2、，成熟的卵母細胞經(jīng)孤雌激活后的胚胎發(fā)育情況；不同的激活電壓和電脈沖時長組合對豬卵母細胞孤雌激活效率和胚胎發(fā)育能力的影響；CHX對豬卵母細胞孤雌激活效率和胚胎發(fā)育能力的影響。（3）不同體外受精液、受精時間、精子上浮時間、精液供體、顆粒細胞存在與否等條件對卵母細胞體外受精效果和胚胎發(fā)育的能力的影響。（4）初生仔豬耳/尾成纖維細胞系的建立及其生物學(xué)特征研究。（5）不同組織來源的供核細胞、不同激活劑或氨基酸培養(yǎng)條件對豬體細胞核移植胚胎的發(fā)育能力

3、的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 實驗一、豬卵母細胞體外成熟條件的研究
　　 （1）不同激素或激素組合對豬卵母細胞體外成熟影響很大，研究中發(fā)現(xiàn)，在含激素成熟液中培養(yǎng)22h后，無激素培養(yǎng)至44h條件下，添加PMSG+hCG組的卵母細胞核成熟率85.9±2.1％，高于FSH+LH組和E2組；不添加任何激素的對照組最低只有33.8±2.2％。
　　 （2）在豬卵母細胞IVM過程中，F(xiàn)SH對豬卵母細胞體外

4、核成熟率的影響較大并與其濃度有關(guān)，隨著FSH濃度上升，豬卵母細胞成熟率隨之上升；LH在低濃度時對豬卵母細胞體外成熟率的影響不大，當(dāng)濃度達到或超過10 IU時對成熟產(chǎn)生促進作用；兩種激素具有相互協(xié)同的作用，當(dāng)在成熟液中添加10 IU/mL的FSH和20 IU IU/mL的LH時，豬卵母細胞成熟率達到最大80.9±2.2％。
　　 （3）在豬卵母細胞IVM液中無論是添加必需氨基酸或非必需氨基酸，或同時添加它們，都能夠提高豬卵母細胞體

5、外核成熟比例。其中添加非必需氨基酸的促進作用最大，核成熟比例最高達到83.0±2.8％；添加了必需氨基酸的成熟比例為78.6±1.5％；同時添加兩種氨基酸為79.9±1.1％，略低于非必需氨基酸組。不添加氨基酸組的對照組成熟率只有74.9±2.4％。
　　 實驗二、豬體外成熟卵母細胞孤雌激活條件研究
　　 （1）在不同激素條件的成熟液中成熟的卵母細胞，在經(jīng)孤雌激活和胚胎培養(yǎng)后孤雌胚胎的發(fā)育能力明顯不同。無激素對照組最低，

6、卵裂率24.4±4.3％，未獲得囊胚；添加PMSG+hCG的成熟液中成熟的卵母細胞激活后，卵裂率和囊胚率最高，分別為85.2±2.4％和55.3±1.3％；
　　 （2）豬卵母細胞孤雌激活的效果與電場強度和脈沖時長之間存在直接的關(guān)系。其中，受電場強度影響最大，在較低電壓范圍內(nèi)，增加電場強度會提高激活效率，在較高電場強度范圍內(nèi)則相反。本研究中電激活的最佳條件為2.0kV/cm、30 ms、1DC，卵裂率達到90.34±1.4％、囊

7、胚率達到46.7±1.9％。
　　 （3）CHX的應(yīng)用能夠提高體外成熟豬卵母細胞孤雌激活效率，這種促進與CHX作用時間和作用方式有關(guān)。電激活后，在CHX中處理8h效果最好，卵裂率87.1±1.6％和囊胚率42.9±1.1％。另外，CHX預(yù)處理也會提高激活效率，其中CHX預(yù)處理15min效果最好。
　　 實驗三、影響豬卵母細胞體外受精的因素研究
　　 （1）豬卵母細胞體外受精效率受多種因素影響，本研究中發(fā)現(xiàn)，將精子

8、上浮處理60min，含2-3層顆粒細胞的卵丘-卵母細胞復(fù)合體在mTBM受精液中與精子共孵育6h條件下的受精效果最好，卵裂率為77.6±2.3％，囊胚率25.7±2.6％。
　　 （2）體外受精效率受提供精液的公豬個體影響很大，不同個體精液的IVF能力差異極顯著。
　　 實驗四、影響體細胞核移植胚胎發(fā)育能力的因素
　　 （1）仔豬耳或尾成纖維細胞在培養(yǎng)過程中的生物學(xué)特征無顯著差異。
　　 （2）不同的激活劑

9、對重構(gòu)胚的激活和胚胎進一步的發(fā)育能力的影響很大，其中CHX的激活和促進胚胎發(fā)育的能力最強，卵裂率67.4±0.6％，囊胚率為19.6±2.1％，6-DMAP次之，CB最差，各組間差異顯著。
　　 （3）不同組織來源的供核細胞對重構(gòu)胚的發(fā)育能力的影響很大，其中初生仔豬耳成纖維細胞作為核供體時的重構(gòu)胚發(fā)育率最高，卵裂率為65.6±3.3％，囊胚率為17.8±2.2％初生仔豬尾成纖維細胞最差，卵丘顆粒細胞供體發(fā)育率居中。