SLAM在結核分枝桿菌感染過程中的作用及機制.pdf

1、結核?。╰uberculosis，TB）是一種古老的嚴重影響人類健康的世界性傳染病。雖然在很大程度上是可以治愈的，但是近年來結核病有卷土重來的趨勢，根據WHO報道，盡管有各種各樣的應對策略，但是僅2010年就新增結核病患者為900萬，并且有140萬人死于結核病。如今結核病再一次成為威脅人類健康的殺手，對于結核分枝桿菌免疫機制的研究也成為各國科學家研究的熱點。
　　結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tubercul

2、osis，M.tb）引起的，其中肺結核約占70％，其他有淋巴結結核、骨結核和腦膜結核等。在肺結核的感染過程中，肺泡巨噬細胞是控制結核分枝桿菌的主要效應細胞之一。但是肺泡巨噬細胞是把“雙刃劍”，它既能夠殺傷一部分入侵的結核分枝桿菌，又能夠成為入侵的結核分枝桿菌的避難所。所以肺泡巨噬細胞與結核分枝桿菌的相互作用直接決定著結核病的發(fā)生、發(fā)展以及預后。因此巨噬細胞在結核病的研究中十分重要。
　　本研究主要從結核分枝桿菌對SLAM表達的調節(jié)

3、，SLAM對結核分枝桿菌識別及SLAM識別結核分枝桿菌對巨噬細胞功能的影響以及SLAM在小鼠感染模型中的作用三個方面研究SLAM在結核分枝桿菌感染中的作用。首先我們成功建立了結核分枝桿菌感染巨噬細胞和小鼠的模型，證明結核分枝桿菌在感染巨噬細胞后可以上調SLAM的表達。然后，我們成功構建了SLAM上調表達及下調表達的真核表達質粒，并通過包裝慢病毒建立了穩(wěn)定上調和下調表達SLAM的RAW264.7巨噬細胞系，進而證明SLAM的上調表達可以促

4、進相關炎癥反應，并且SLAM的上調或下調表達可以影響巨噬細胞對結核分枝桿菌的殺傷。但是SLAM不可以直接結合BCG，也不會在BCG感染后參與自噬小體的形成。我們通過聚乙烯亞胺包裹質粒的方法在體內對SLAM的表達進行上調和下調干預，結果證明SLAM的表達可以促進肺臟炎癥反應，增強肺部病理變化的程度，促進肺部結核分枝桿菌的清除。從而為進一步研究結核分枝桿菌在機體內的免疫機制提供一定的理論依據，進而為新型疫苗的研發(fā)和免疫治療方法的創(chuàng)新提供了新

5、的方向。
　　一、結核分枝桿菌對SLAM表達的調節(jié)
　　1.結核分枝桿菌感染模型的建立
　　為了研究SLAM在結核分枝桿菌感染過程中的作用，根據文獻我們建立了結核分枝桿菌感染的小鼠模型和細胞模型。每只C57BL/6J小鼠經鼻腔滴入1×107CFU的BCG，4周后取樣檢測。病理切片和菌落形成單位（CFU）實驗結果證明，正常小鼠肺臟經過HE染色后可以看到肺泡壁很薄，沒有炎癥細胞浸潤及出血等癥狀，而結核分枝桿菌感染后的小鼠肺

6、臟可以明顯看到肺泡壁變厚，肺間質有大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔有出血癥狀。另外感染后的小鼠肺臟中能檢出約105-106數(shù)量級的結核分枝桿菌，未感染小鼠的肺臟中則沒有該菌檢出。綜上結果說明小鼠感染模型建立成功。同時我們以（MOI10:1）的量用BCG感染RAW264.7細胞，6小時后檢測該細胞中炎癥相關細胞因子的mRNA水平，結果顯示BCG感染后各炎癥因子都有明顯上調，與文獻報道相符，證明細胞感染模型的建立成功。
　　2.結核分枝桿菌的

7、感染可以上調SLAM的表達
　　在結核分枝桿菌感染模型建立后，我們用流式細胞術檢測了小鼠肺臟巨噬細胞上SLAM的表達情況，實驗結果證明在感染BCG后，小鼠肺臟巨噬細胞上SLAM會上調表達，SLAM陽性的巨噬細胞比例由感染前的12%左右上升到感染后的19%左右。RAW264.7細胞在感染BCG后，SLAM的表達也會上調。Real-time PCR結果顯示感染BCG后6h SLAM的mRNA水平上調80倍左右，流式結果顯示在BCG感染

8、24h后SLAM蛋白表達水平上調3倍左右。
　　二、SLAM對結核分枝桿菌的識別及對巨噬細胞功能的影響
　　1. SLAM基因的克隆及各真核表達載體的構建
　　為了研究SLAM在結核分枝桿菌感染過程中的作用，我們設計相關引物，構建了SLAM的上調表達載體。首先我們設計了特異性引物從小鼠脾臟總RNA中成功擴增出SLAM基因，測序正確后將其插入到pcDNA3.1（-）和pDsRED-N1兩個真核表達載體中。細胞轉染后經we

9、stern blot和免疫熒光檢測，pcDNA3.1-SLAM和pDsRED-N1-SLAM都能夠正常表達。
　　2.SLAM基因上調及下調表達慢病毒載體的構建、病毒包裝及相應細胞株的建立
　　為了研究SLAM在結核分枝桿菌感染過程中的作用，我們設計了相關引物及shRNA，構建了SLAM的上調和下調表達慢病毒載體載體，并用包裝的病毒建立了穩(wěn)定表達細胞系。首先我們根據shRNA原則設計了針對載體pLL3.7的shRNA，和針對

10、載體pMSCV的引物。經測序鑒定pLL3.7-shRNA-SLAM和pMSCV-SLAM構建成功。然后將構建好的病毒包裝載體與各自對應的輔助載體以一定比例共轉染293T細胞，48h后收集含病毒的細胞上清，感染RAW264.7細胞。感染后36h觀察綠色熒光蛋白的表達。然后流式細胞儀分選得到高純度的SLAM表達上調或下調的RAW264.7細胞。
　　3.SLAM能增強BCG感染后巨噬細胞的炎癥反應
　　在BCG感染SLAM上調或

11、下調RAW264.7細胞后，我們用Real-time PCR的方法檢測了細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6各炎癥因子的mRNA表達水平。結果顯示，在SLAM上調表達后，巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基礎表達都有所下降，其中IL-1β和IL-6下降約兩倍（P<0.05），TNF-α有下降趨勢。奇怪的是在BCG感染后，卻出現(xiàn)相反的現(xiàn)象，SLAM上調表達組的TNF-α和IL-1β表達顯著高于對照組（P<0.05）。然而IL-

12、6的表達卻不同，與對照相比，在BCG感染后其表達沒有像TNF-α和IL-1β那樣上升，反而呈下降趨勢（P<0.05）。在下調SLAM的表達后，巨噬細胞內促炎因子的基礎表達水平有上升趨勢。在SLAM下調表達后，巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基礎表達都有所上升，其中IL-1β和IL-6上升很明顯（P<0.05），TNF-α僅表現(xiàn)出上升趨勢。有趣的是BCG感染后，與對照組相比SLAM下調組的TNF-α和IL-1β表達則顯著下降（

13、P<0.05）。IL-6的表達依然與眾不同，與對照相比，在BCG感染后其表達沒有像TNF-α和IL-1β那樣下降，反而呈上升趨勢（P<0.05）。
　　三、SLAM在小鼠感染模型中的作用
　　1.SLAM促進結核分枝桿菌感染后的炎癥反應
　　為了研究小鼠感染結核分枝桿菌后SLAM在體內的功能，我們以PEI包裹質粒體內轉染的方法在小鼠體內上調和下調表達SLAM，滴鼻感染BCG，4周后取小鼠肺臟做病理切片，HE染色后鏡下觀

14、察。結果發(fā)現(xiàn)，在BCG感染后各組小鼠的肺臟都有病變及炎癥浸潤。但是對比發(fā)現(xiàn)，SLAM上調組小鼠的肺臟炎性浸潤最嚴重，呈現(xiàn)實質性病變，形成大量結節(jié)，其對照組的炎性浸潤相對較輕，形成的實質性結節(jié)也相對較??；SLAM下調組小鼠的肺臟炎性浸潤最少，只有很小的實質性結節(jié)形成，而其對照組病變則較為嚴重。通過肺損傷評分能很直觀的看出，SLAM上調可以促進小鼠肺部炎癥的發(fā)生，SLAM下調可以抑制小鼠肺部炎癥的發(fā)生（P<0.05）。
　　2.SLA

15、M促進小鼠對結核分枝桿菌的清除
　　結核分枝桿菌能逃逸機體免疫系統(tǒng)的殺傷和清除，這是其難以防治的一個主要因素。為了研究SLAM在結核分枝桿菌感染小鼠模型中是否對該病菌的生存與繁殖產生影響，我們做了小鼠肺臟的病理切片，并且用抗酸染色法檢測肺臟中BCG的存在。結果顯示與對照組相比，SLAM上調表達小鼠的肺臟中呈紅色的BCG數(shù)目最少，這或許與其炎癥程度有關，較強的炎癥反應促進了機體對BCG的殺傷與清除；SLAM下調組小鼠肺臟中的BCG最

16、多，與對照組小鼠相比，SLAM下調組小鼠的肺臟很多細胞中都有紅色BCG的存在。另外CFU實驗結果顯示SLAM下調組結核分枝桿菌的CFU高于其他組，SLAM上調組結核分枝桿菌的CFU低于其對照組（P<0.05）。
　　3.SLAM對小鼠肺臟巨噬細胞炎癥因子的影響
　　在體外SLAM能在巨噬細胞上調節(jié)炎癥相關細胞因子的表達，并且在體內SLAM也能影響結核分枝桿菌感染后小鼠肺臟的病理變化，那么SLAM能否在體內影響小鼠肺臟巨噬細胞

17、炎癥因子的表達還不清楚。為此我們在上調和下調表達SLAM的小鼠感染結核分枝桿菌4周后，取其肺臟制成單細胞懸液，用流式細胞儀分析CD11b+F4/80+陽性的巨噬細胞中TNF-α和IL-10的表達情況。結果顯示，SLAM上調組小鼠TNF-α陽性的肺臟巨噬細胞多于其對照組（P<0.05）；SLAM下調組小鼠TNF-α陽性的肺臟巨噬細胞少于其對照組（P<0.05）。流式分析發(fā)現(xiàn)，SLAM下調組小鼠IL-10陽性的肺臟巨噬細胞多于其對照組（P<