體外腦膠質瘤干細胞的放化療抵抗性研究.pdf

1、在全身惡性腫瘤中，惡性膠質瘤的5年死亡率就僅次于胰腺癌和肺癌，5年生存率不足5％。腦膠質瘤約占顱內腫瘤的半數以上，腦膠質瘤的發(fā)病率為3-10/10萬，占全身惡性腫瘤的1-3％。低級別膠質瘤在病理上近于良性，侵襲性較小，即便如此，仍有將近一半的病人存活期不超過5年，腫瘤將從惡性程度較低的膠質瘤發(fā)展到惡性程度較高的膠質瘤，最后患者差不多都由于腫瘤復發(fā)和/或局部侵襲而死亡。
　　 目前手術切除是膠質瘤是最基本、最直接的治療方法，治療作

2、用十分明確，其主要目的是降低致殘率和死亡率，最大程度的提高患者的生存質量和生存時間。但由于膠質瘤多呈侵潤性生長，手術過程中難以通過肉眼分辨其明確邊界，腫瘤常常難以徹底完全切除，因此在術后常常需要輔以放療、化療[1]。另有一部分患者因病變較小、位于功能區(qū)或因年齡較大、身體一般狀況差，拒絕或不宜行開顱手術治療而單純選擇放療或化療作為治療手段。
　　 放射治療主要是利用放射線的穿透性和使生物細胞電離的特性，常用的射線有X線和γ線等，X

3、線和γ線等進入組織后和活體組織中的原子相互作用，傳遞電離輻射能量。具有生物活性的組織吸收電離輻射能量后產生一系列異常復雜的物理、化學和生物學變化而導致組織的放射性損傷。放射治療包括普通放射治療、組織間的近距離照射和精確放射治療，精確放射治療又包括三維適形或調強放射治療以及立體定向放射治療（即X刀、γ刀）。無論采用哪種放射治療方法，它們均是通過使用x射線、γ射線等引起腫瘤組織、細胞的電離輻射效應而達到治療目的[2]。
　　 膠質瘤

4、的化學藥物治療和手術、放射治療一起構成了膠質瘤綜合治療體系，化學治療可以殺死手術后或者放療后的微小病灶，延緩膠質瘤的復發(fā);或者使原本不能手術或不適宜手術的病人可以接受手術。但化學藥物治療也有比較大的副作用，全身用藥毒性較大，同時可能對患者的免疫系統(tǒng)造成抑制?；瘜W治療藥物分為兩大類，分別為細胞周期特異性藥物和細胞周期非特異性藥物。在選擇化療方案時常?？紤]兩類藥物聯(lián)合使用。
　　 雖然目前膠質瘤的綜合治療體系包括手術、放療和化療以及

5、目前正在進行臨床研究的基因治療、免疫治療等，但是膠質瘤的療效在10余年內仍然沒有明顯進展，最后患者幾乎由于腫瘤局部擴散或局部侵襲或復發(fā)死亡。特別是惡性膠質瘤的治療，即使手術加放化療的中位生存期也僅為14.6個月[4]。目前神經外科學者普遍認為，膠質瘤治療的關鍵問題在于現(xiàn)有治療不能有效抑制或延緩腫瘤復發(fā)。
　　 最近的研究認為[6]，腫瘤是由一小群具有無限增殖及自我更新能力的干細胞樣細胞及由其產生的分化程度不均一的細胞團組成，這群

6、干細胞樣細胞被稱為腫瘤干細胞(Tumor stem cell，TSC)，而腫瘤的主體卻是由失去了自我更新能力的具有一定分化特征的非干細胞樣細胞組成。腫瘤干細胞假說最重要的特征是，腫瘤中僅腫瘤干細胞具有產生腫瘤及導致腫瘤治療后復發(fā)的能力。腫瘤干細胞學說[7]的提出對于認識腫瘤的本質，開發(fā)新的腫瘤治療方法具有重要意義，傳統(tǒng)的治療方法，包括手術、放療和化療，是以整體腫瘤細胞作為治療靶的，并沒有專門針對于腫瘤干細胞。治療的結果就極有可能剩下具有

7、致瘤性并對治療具有更強抵抗性的腫瘤干細胞，從而導致腫瘤容易復發(fā)，難以根治。
　　 膠質瘤干細胞就是在此基礎上逐漸提出來的，最早被稱為神經干細胞樣細胞(neural stem-like cell)。膠質瘤干細胞學說的重要意義在于，如果我們能夠特異性的識別膠質瘤干細胞，并開發(fā)出特異性針對膠質瘤干細胞的靶向治療方法我們就才有可能徹底征服膠質瘤。
　　 根據上述腫瘤干細胞和膠質瘤干細胞的學說，認為在腦腫瘤組織和體外培養(yǎng)的膠質瘤細

8、胞系中存在有膠質瘤干細胞，并且由于膠質瘤干細胞對目前的治療方法具有一定的抵抗作用而導致膠質瘤在治療后部分干細胞存活下來，導致膠質瘤在術后出現(xiàn)復發(fā)。本課題就是在這樣的思路下進行設計進行的。
　　 首先在第一部分，我們將兩例新鮮惡性膠質瘤組織細胞和U251細胞接種在含血清培養(yǎng)基中，待細胞生長良好時，將細胞接種至無血清培養(yǎng)基中（DMEM/F12培養(yǎng)基，內含B2720ul/ml，bFGF20ng/ml，EGF20ng/ml，LIF10n

9、g/ml）收集懸浮生長的神經球樣細胞，這些神經球樣細胞經過無血清培養(yǎng)、傳代和擴增后，再通過免疫熒光細胞化學的方法來檢測這些神經球樣細胞是否表達干細胞表面標志物CD133和ABCG2;再通過流式細胞儀檢測在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長形成的球樣體細胞CD133和ABCG2的表達;然后運用免疫磁珠分選的方法，以CD133為標志物，分選出CD133表達陽性的膠質瘤干細胞;通過反復傳代培養(yǎng)的方式、單細胞克隆形成的方法和細胞移植裸鼠致瘤等方法來對其干細

10、胞特性進行檢測。結果我們發(fā)現(xiàn)，在新鮮的膠質瘤組組織細胞和U251細胞系中，通過在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，可以得到呈懸浮生長的細胞球;經過免疫熒光細胞化學法檢測，可以發(fā)現(xiàn)細胞球細胞有明顯CD133和ABCG2的陽性表達;但經過流式細胞儀檢測CD133和ABCG2的表達后發(fā)現(xiàn)，在懸浮生長的細胞球里，U251細胞球中CD133+細胞僅為3.17％，而ABCG2+細胞僅為1.17％;而在人新鮮膠質瘤組織細胞里，兩者的陽性表達率分別為9.68％、1

11、1.25％和14.2％、17.8。經過CD133標記的免疫磁珠分選后CD133陽性表達分別為88.2％、91.5％、87.4％。我們將分選后的CD133+細胞和CD133-細胞分別進行了單細胞克隆形成試驗，結果顯示CD133+細胞克隆形成率達到78.5-92.4％，而CD133-細胞的僅有1.5％-4.7％。在裸鼠移植致瘤實驗中，分別以CD133+細胞為102-103細胞/ml,CD133-細胞為1-5×105細胞/ml的密度以1ml接

12、種裸鼠腹部，CD133+細胞成瘤率達到80％(4/5)。通過第一部分的研究，我們發(fā)現(xiàn):在膠質瘤組織和體外傳代培養(yǎng)的U251膠質瘤細胞系中，的確有一小部分細胞表達干細胞表面標志物CD133和ABCG2;可在體外培養(yǎng)反復傳代，保持自我更新和無限增殖能力;經過以CD133為標記的免疫磁珠分選后可以分離純化膠質瘤干細胞;CD33+細胞的單細胞克隆形成率以及裸鼠移植成瘤率都比CD133-細胞高。因此，我們可以認為這一小部分表達干細胞表面標志物的細

13、胞群就是膠質瘤干細胞。
　　 在第二部分中，我們將分離鑒定得到的膠質瘤干細胞，使用X線高能直線加速器對干細胞進行X線輻射處理，通過MTT比色法來檢測輻射后不同時間的細胞活性變化情況;在輻射處理72小時后流式細胞儀檢測CD133和ABCG2表達并用Hochest3325染色檢測凋亡細胞核;使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒來檢測輻射處理后細胞的凋亡情況;通過以上的檢測結果來研究膠質瘤干細胞對放射治療的反應情況;最后我

14、們將經過6Gy輻射處理后72小時的細胞與未經過X線輻射處理的細胞進行配對處理，在替莫唑胺(TMZ)半數抑制濃度作用48小時后MTT比色法進行細胞活性檢測、Annexin V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡率，對目前膠質瘤臨床治療放化療聯(lián)合方案對膠質瘤干細胞的作用效果進行研究。結果顯示:1在X線不同輻射劑量照射后，U251細胞以及U251腫瘤球細胞隨著輻射劑量的增加以及作用時間延長，細胞的的活性顯著下降(P＜0.01);在相同劑量的不同作用時

15、間下細胞活性顯著性下降(P＜0.01)，但在3Gy輻射劑量時，在48hr與72h之間U251細胞的活性差異性不顯著(P=0.057);2在X線照射處理72h后，流式細胞學檢測CD133和ABCG2的表達，結果顯示，在3Gy、6G、9Gy的X線照射72h后，CD133的表達由3.17％上升到4.74％、8.35％、13.24％;ABCG2的表達上升到1.48％、3.51％、8.76％。3在72h后，hochest染色可見到各期細胞凋亡的細

16、胞核改變情況;4 AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒分別檢測了CD133+和CD133-細胞凋亡率以及人膠質瘤細胞系U251腫瘤細胞球和U251細胞凋亡率。其中CD133+細胞3Gy、6Gy、9Gy的劑量照射后72h的凋亡率分別為2.64±0.82％、4.53±1.19％、6.07±1.52％; CD33-細胞分別為9.73±0.92％、17.94±1.33％、25.19±1.56％;經過統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn):輻射處理后72小時CD1

17、33+細胞的凋亡率，在3Gy和6Gy放射劑量以及6Gy和9Gy放射劑量在統(tǒng)計學上沒有差異性(P＞0.05)，3Gy和9Gy的劑量下，凋亡率有顯著性差異(P＜0.01);CD133+細胞和CD133-陰性細胞、U251細胞以及U251細胞球細胞的凋亡率在同一X線劑量下有顯著性差異(P＜0.01); U251細胞球細胞和CD133-細胞和U251細胞凋亡率在同一X線劑量下有顯著性差異;U251細胞和D133-細胞之間在同一輻射劑量下凋亡率無

18、統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。5將X線照射后CD133+細胞和CD133-細胞以及腫瘤球干細胞樣細胞與未經照射處理的細胞配對處理后，接受替莫唑胺(TMZ)藥物作用。分別在藥物作用前和藥物作用后48hMTT比色法檢測細胞活性以及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢查其凋亡率變化。結果顯示sphere、Sphere/IR、CD133+、CD133+/IR、CD133-、CD133-/IR各類細胞在藥物作用前MTT比色法檢測OD值為1

19、.241±0.11、0.785±0.055、1.257±0.08、1.147±0.084、1.241±0.103、0.568±0.046;在48h后為0.569±0.032、0.424±0.036、1.142±0.071、0.907±0.042、0.632±0.063、0.234±0.040。在藥物作用前的凋亡率分別是:0.53±0.12％、12.63±2.0％、0.40±0.09％、4.58±0.52％、0.60±0.4％、17.91

20、±2.0％;藥物作用48h后為18，75±2.7％、51.99±5.2％、2.62±0.7％、17.09±1.9％、21.98±3.4％、42.33±3.5％。經配對T檢驗和單因素方差分析表明在替莫唑胺(TMZ)作用前后，CD133+細胞在藥物作用前后的OD值變化無統(tǒng)計學差異;其余不同細胞組在藥物處理前后，其吸光度均有顯著性差異(P＜0.01);在替莫唑胺(TMZ)作用前后，其他細胞組，和CD133+細胞組比較，其MTT比色法檢測OD值

21、變化有顯著性差異(P＜0.01);但在輻射處理后的細胞之間，其OD值的變化無統(tǒng)計學差異;藥物作用前后的凋亡率在不同細胞組之間，與CD133+細胞組比較，藥物處理前后細胞的凋亡率有顯著性差異(P＜0.01)。通過第二部分的研究，我們發(fā)現(xiàn):在X線不同輻射劑量照射后，細胞的活性隨著放射劑量的增加和時間的延長而下降，凋亡率隨著放射劑量的增加和時間的延長而逐漸增加;隨著放射劑量的增加，懸浮生長的細胞球中干細胞標志物的表達增加;在輻射處理72小時后

22、，免疫磁珠分選的CD133+細胞的凋亡率在3、6Gy和6Gy、9Gy之間在統(tǒng)計學上無顯著性差異。這提示著表達CD133的膠質瘤干細胞對X線輻射具有一定的抵抗性，因而在輻射處理后，其細胞凋亡率沒有隨著輻射劑量的增加而出現(xiàn)相應的上升。我們將X線照射后CD133+細胞和CD133-以及腫瘤球干細胞樣細胞與未經照射處理的細胞配對處理，分別檢測在TMZ作用前后的細胞活性以及凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)以CD133為標志的膠質瘤干細胞對TMZ具有抵抗性，與輻