膠質(zhì)瘤干細胞中耐藥基因的表達與化療之間的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　 腦腫瘤干細胞(braintumorstemcells,BTSC)的發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤化療耐藥機理提供了新的假說,即是因為腫瘤干細胞發(fā)生了耐藥,而BTSC發(fā)生耐藥的主要原因是相關(guān)耐藥基因的表達,其中比較重要的是ABCG2。通過化療殺死敏感細胞,存留細胞即為耐藥細胞,這些細胞與BTSC之間的關(guān)系是解開耐藥機理的重要途徑,目前還不清楚。本研究以膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞為靶細胞,通過化療過程對BTSC數(shù)量及生物學特性影響的研究,探討腫瘤

2、干細胞與化療耐藥之間的關(guān)系。分為三部分:1.膠質(zhì)瘤U251細胞中CD133+細胞比例及干細胞特性分析;2.替莫唑胺(TMZ)化療對U25l細胞中CD133+細胞的影響;3.替莫唑胺化療對U251細胞中CD133+細胞中耐藥基因表達的影響。
　　 方法：
　　 第一部分:利用免疫熒光染色檢測膠質(zhì)瘤U251細胞中CD133、巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白(GFAP)等蛋白表達

3、,分析CD133+細胞與CD133-細胞中Nestin、NSE、GFAP陽性細胞存在的差異。第二部分:通過MTT實驗評估U251細胞對TMZ的敏感性。利用免疫熒光染色和Westemblot檢測TMZ作用前后U251細胞中CD133、Nestin、NSE、GFAP等基因表達,分析TMZ對CD133+細胞的影響。第三部分:利用免疫熒光染色和Westernblot檢測TMZ作用前后膠質(zhì)瘤U251細胞中ABCG2、MRP及P-gp等耐藥基因的表

4、達,分析化療對CD133+細胞中耐藥基因表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:膠質(zhì)瘤U251細胞中CD133+細胞比例為0.060±0.003;在CD133+細胞中,Nestin陽性細胞,NSE和GFAP陰性細胞比CD133-中明顯增多;在CD133-細胞中,也存在Nestin陽性細胞,數(shù)目較CD133+中明顯減少,相反Nestin陰性細胞,NSE和GFAP陽性細胞明顯增多。第二部分:在膠質(zhì)瘤U251細胞中,未加入

5、TMZ組CD133+細胞比例為60%左右,加入TMZ組CD133+細胞比例為33.7%左右,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CD133+細胞中Nestin陽性細胞的比例在TMZ作用后明顯增加(P＜0.05),而GFAP和NSE陽性細胞比例明顯減少(P＜0.05)。Westernblot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD133和Nestin在TMZ作用前后均有表達,在作用后明顯增加(P＜0.05);相反,GFAP和NSE表達在TMZ作用后明顯減

6、少(P＜0.05)。第三部分:①通過MTT評估發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤U251細胞在不同濃度的TMZ作用下,隨著濃度的升高,各濃度組的細胞存活率逐漸遞減,但是第3天后有所緩和,第5天與第3天比較,無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);U251細胞在TMZ濃度為0.05g/L以上,即使?jié)舛仍黾?細胞抑制率亦無明顯改變,上述結(jié)果提示U251細胞對TMZ存在耐藥現(xiàn)象。②在TMZ作用前CD133+細胞中ABCG2、P-gp及MRP等耐藥基因的表達明顯低于TMZ作用

7、后(P＜0.05)。③western-blot檢測發(fā)現(xiàn),ABCG2、P-gp及MRP等在TMZ作用前后均有表達,但是在TMZ作用后明顯增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.膠質(zhì)瘤U251細胞存在CD133+細胞,在CD133陽性和陰性細胞中,均存在干細胞樣細胞,但是在CD133+細胞中此類細胞更多。2.U251細胞對TMZ存在耐藥現(xiàn)象,主要原因可能與CD133+細胞數(shù)量的增多及其耐藥基因ABCG2、P-gp及M