IL-17促進CD133+卵巢癌干細胞樣細胞自我更新的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌目前是死亡率最高的婦科腫瘤疾病，發(fā)病隱匿、高復發(fā)及易擴散轉移是其重要的臨床特征。越來越多的研究證明，惡性腫瘤組織中存在著一小部分擁有干細胞樣細胞性質的群體，即腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)或稱為腫瘤干細胞樣細胞(cancerstem-like cells，CSLCs)，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及侵襲轉移中起著十分重要的作用。在卵巢癌中也存在著腫瘤干細胞，即卵巢癌干細胞(ovari

2、an cancer stem cells，OCSCs)，其對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及轉移同樣具有重要作用。因此，從卵巢癌干細胞樣細胞這一角度進行研究是治療卵巢癌的新策略。
　　腫瘤干細胞與普通腫瘤細胞相比，除了具有更強的侵襲、轉移能力，更強的化療抵抗能力以外，最本質的差別是其具有干細胞特性，即自我更新(self-renewal)。不管是腫瘤的發(fā)生還是復發(fā)和轉移灶的形成，都有賴于腫瘤干細胞的自我更新能力。因此，闡明腫瘤干細胞的自我

3、更新機制是研究腫瘤干細胞的關鍵。
　　腫瘤干細胞的自我更新不僅依賴于其自身內在的信號調控，同時也受到腫瘤微環(huán)境的調控，其中，腫瘤相關性炎癥最為關鍵。然而腫瘤相關性炎癥對卵巢癌干細胞的自我更新調控作用及機制卻缺乏系統(tǒng)深入的研究。
　　我們前期從卵巢癌中成功分離出的CD133+卵巢癌干細胞樣細胞(CD133+ ovariancancer stem-like cells，CD133+ OCSLCs)具有腫瘤干細胞的特性，其能夠作為

4、我們研究卵巢癌干細胞自我更新生物學特性的模型。為此，本課題探討腫瘤相關性炎癥對CD133+OCSLCs自我更新的調控作用及其機制。
　　研究目的：
　　1.檢測CD133+ OCSLCs相關性炎癥因子及其受體的表達。
　　2.明確IL-17在CD133+ OCSLCs自我更新中的作用。
　　3.闡明IL-17調控CD133+ OCSLCs自我更新的機制。
　　研究方法：
　　圍繞上述研究目的，我們采用

5、以下研究方法:
　　一、CD133+ OCSLCs相關性炎癥因子及其受體
　　1.通過人炎癥反應PCR芯片(Human Inflammatory Response PCR Array)技術，比較A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌細胞系細胞)中炎癥因子和相關受體mRNA的表達。
　　2.通過流式細胞、免疫熒光技術驗證IL-17R在A2780卵巢癌細胞系，A

6、2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs和人卵巢癌組織中的表達情況。
　　二、IL-17在CD133+ OCSLCs自我更新中的作用
　　1.通過免疫組化，免疫熒光技術檢測IL-17的來源細胞。
　　2.通過腫瘤干細胞成球實驗及受體阻斷實驗研究IL-17體外對A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs和原代卵巢癌細胞來源的CD133+ OCSLCs自我更新的作用。
　　3.通過構建IL-1

7、7過表達慢病毒后裸鼠體內荷瘤實驗研究IL-17對A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs體內成瘤能力的影響。
　　三、IL-17調控CD133+ OCSLCs自我更新作用的機制
　　1.通過全基因組表達譜芯片技術篩選IL-17調控A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs自我更新的相關基因并通過qPCR驗證。
　　2.結合自我更新相關基因和生物信息學方法篩選IL-17下游信號通路。
　　

8、3.通過western-blot，免疫熒光和抗體阻斷等方法研究NF-κB及p38MAPK兩條信號通路在IL-17調控CD133+ OCSLCs自我更新中的作用。
　　研究結果：
　　1.CD133+OCSLCs表面表達IL-17R
　　我們通過PCR-array技術，比較了A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs和非OCSLCs之間的基因差異，結合這些差異基因的生物學作用，我們選擇對IL-17參與CD13

9、3+ OCSLCs自我更新進行深入研究。
　　免疫熒光和流式細胞技術結果顯示A2780卵巢癌細胞系來源的CD133+ OCSLCs表面表達IL-17R并且其表達高于非OCSLC。在新鮮人卵巢癌組織中，通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)IL-17R表達于原代卵巢癌來源的CD133+ OCSCs表面。提示IL-17與CD133+ OCSLCs具有相互作用的物質基礎。
　　2.IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新
　　因為IL-1

10、7R需要與其配體IL-17相結合才能發(fā)揮功能，因此我們首先通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)人新鮮卵巢癌組織中存在表達IL-17的細胞，其主要分布于卵巢癌間質內。免疫熒光進一步證實:表達IL-17的細胞主要為CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞，并且這類細胞與CD133+ OCSLCs在人卵巢癌組織中處于同一niche之中。提示IL-17與CD133+OCSLCs具有空間上相互作用的可能性。
　　通過衡量A2780卵巢癌細胞系和原代卵巢癌細胞來源

11、的CD133+ OCSLCs在IL-17刺激后的成球數(shù)量和成球大小，證明IL-17具有促進CD133+ OCSLCs自我更新的作用，經過IL-17R抗體阻斷實驗進一步證明IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新的作用依賴于IL-17R。
　　通過慢病毒介導的基因轉染方法建立穩(wěn)定表達人IL-17的CD133+ OCSLCs，結合免疫熒光和ELISA驗證IL-17轉染效率，成球和受體阻斷功能實驗驗證IL-17轉染后促進CD13

12、3+ OCSLCs自我更新。通過裸鼠體內荷瘤實驗證明IL-17具有促進CD133+ OCSLCs體內成瘤的能力。
　　3.IL-17通過NF-κB和p38MAPK兩條信號通路調控CD133+ OCSLCs自我更新
　　通過基因表達譜芯片比較IL-17刺激和未刺激的卵巢癌細胞系來源的CD133+OCSLCs差異基因，在此基礎上分別通過:1.篩選出8個自我更新相關基因，qPCR驗證后，通過在線轉錄因子查找的方法，證實p65和/或

13、AP1為8個自我更新相關基因的轉錄因子（除TCL1A）;2.生物信息學信號通路預測篩選出NF-κB和MAPK兩條信號通路。因為p65和AP1分別是NF-κB和p38MAPK兩條信號通路的終末轉錄單位，提示NF-κB和p38MAPK兩條信號通路可能是IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新的調控機制，其與生物信息學信號通路預測篩選出來的NF-κB和MAPK兩條信號通路相一致。
　　為了明確NF-κB和p38MAPK兩條信號通

14、路介導IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新，我們通過western-blot、ELISA和免疫熒光技術檢測p65和p38，發(fā)現(xiàn)CD133+OCSLCs在IL-17刺激5min后，p65和p38開始入核增加并伴隨著胞漿蛋白的相應減少。為了進一步確定NF-κB和MAPK兩條信號通路介導IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新，在IL-17刺激CD133+ OCSLCs的情況下，分別加入p65阻斷劑PDTC和/或p38阻斷

15、劑SB203580，觀察成球數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者阻斷劑能夠分別或協(xié)同抵制IL-17促進CD133+OCSLCs的自我更新現(xiàn)象。由此在IL-17促進CD133+ OCSLCs自我更新的過程中形成了一個由NF-κB和p38MAPK兩條信號通路介導的調控新機制。
　　研究結論：
　　在卵巢癌中，分泌IL-17炎癥細胞因子的CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞與CD133+OCSLCs共同處于同一niche中，IL-17炎癥因子能夠與表達于