甜菜夜蛾與棉鈴蟲內源性piggyBac轉座子的研究.pdf

1、piggyBac轉座子是典型的DNA轉座子,最初是從粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的細胞系中分離出來的。由于該轉座子在多種昆蟲的基因組上都具有高轉座活性,因此piggyBac已經成為一種高效的轉基因載體廣泛用于昆蟲的轉基因研究和實踐?，F在普遍認為,在轉座子介導的轉基因昆蟲中,內源性同源轉座子將影響昆蟲轉基因的成功率和穩(wěn)定性。因此有必要對目標昆蟲進行內源性轉座子的調查分析。由于轉座子很難用常規(guī)的RT-PCR和RACE技術進行克

2、隆鑒定,故本研究在兼并引物PCR的基礎上,利用inverse PCR和vectorret PCR技術,不僅調查了鱗翅目兩種重要的農業(yè)害蟲甜菜夜蛾和棉鈴蟲的內源piggyBac存在情況,同時克隆到了內源性的piggyBac轉座子,并且從棉鈴蟲中獲得了一個結構完整、具有潛在活性的piggyBac轉座子HaPLE1。 1 甜菜夜蛾piggyBac轉座子基因的克隆與序列分析 采用PCR技術,利用兼并引物,從甜菜夜蛾基因組中克隆出

3、一個內源性piggyBac類似因子的DNA片段,并命名為SePLE。該基因片段長456bp,推導的氨基酸序列與幾種昆蟲中的piggyBac氨基酸序列的相似性迭50％-78％,但中間出現1個終止密碼子。根據這個片段,通過inverse PCR技術,雖然克隆到兩個不同的基因拷貝(SePLE1和SePLE2),但兩個拷貝不僅都缺失了特征性的短末端重復序列,而且編碼轉座酶的開放閱讀框中也都出現了多個突變(終止密碼子),由此認為,甜菜夜蛾體內具有

4、內源性piggyBac類似因子,但本研究所克隆的拷貝SePLE1和SePLE2已經喪失了轉座活性。 2 棉鈴蟲piggyBac轉座子基因的克隆與序列分析 利用兼并引物PCR、inverse PCR和vectorret PCR技術,從棉鈴蟲的基因組中克隆獲得了2+piggyBac類似因子基因的DNA全長,并分別命名為HaPLE1和HaPLE2。其中HaPLE1(GenBattk accession number:EF593

5、176)全長2500bp,含有編碼597個氨基酸的1794bp開放閱讀框(ORE),具有16bp末端反向重復序列(ITR)和piggyBac轉座子家族特征性的TTAA插入序列。HaPLE1轉座酶的氨基酸序列與其它昆蟲piggyBac因子的相似性很高,與家蠶Bombyx mori的yabusame-1的相似性為46％,與煙芽夜蛾Heliothis virescens的HvPLE1的相似性為48％,與桔小實蠅Bactrocera dorsa

6、lis的piggyBac類似因子的相似性為67％,與粉紋夜蛾T.ni的IFP2的相似性為78％。同時HaPLE1推導的氨基酸序列中還具有可能構成DDD結構域的四個天冬氨酸D268,D346,D447和D450。由此認為HaPLE1是自主性因子,具有潛在的轉座活性。而HaPLE2全長只有982bp,與HaPLE1的相似很高,并具有完全相同的ITR列和插入序列,但缺失了大部分的轉座酶編碼序列。 3 棉鈴蟲piggyBac基因旁側序列

7、的克隆 進一步進行TE展示研究表明,棉鈴蟲piggyBac類似因子在基因組中的拷貝數較少,在同一品系的不同個體中有不同的插入位點。利用vectorret PCR克隆了12個棉鈴蟲個體中piggyBac轉座子基因的旁側序列,通過測序獲得了12個5'上游旁側序列和8個3'下游旁側序列。序列分析表明,其中的11個5'上游旁側序列和7個3'下游旁側序列都屬于HaPLE2。將獲得的12個上游旁側序列和8個下游旁側序列,進行Blast同源性

8、搜索,結果都沒有找到相應的基因,表明piggyBac類似因子更傾向于插入基因間隔區(qū)或者基因非編碼區(qū),從而不影響基因功能或者正常表達。由此認為,piggyBac侵入棉鈴蟲種群歷史不長,HaPLE1是棉鈴蟲的一個結構完整的piggyBac類似因子,可能仍然具有轉座活性；而HaPLE2可能是由HaPLE1發(fā)生缺失和突變而來的非自主性轉座子；這些轉座子如果轉座插入功能基因區(qū),很可能產生致死效應。 4 HaPLE1,HaPLE2在棉鈴蟲不

9、同地理品系的分布 在棉鈴蟲piggyBac類似因子HaPLE1和HaPLE2核苷酸序列的相同區(qū)域設計特異性引物,利用PCR方法調查這兩個基因在三個不同的棉鈴蟲地理種群NJ品系,GY品系以及Oxford品系中的存在情況。結果發(fā)現HaPLE2因子存在于三個品系的所有被調查的棉鈴蟲個體,而HaPLE1存在于NJ品系35％的個體中,存在于GY品系35％的個體中,以及Oxford品系24％的個體中。由此我們可以得出以下兩點推論：第一,pi

10、ggyBac類似因子在二十年前就已經存在于棉鈴蟲的基因組中。因為Oxford品系是二十年前采集于自然界中,之后在室內連續(xù)飼養(yǎng)。第二,HaPLE1可能仍具有轉座活性。因為當一個轉座子失去活性時就被固定在基因組上,這個基因也會由于遺傳而出現在下一代的基因組中,當在室內連續(xù)飼養(yǎng)幾代之后,這個基因就會存在于幾乎所有的個體中,而HaPLE1只存在于24-35％的棉鈴蟲個體的基因組中。 5 piggyBac轉座子基因的親緣關系樹分析

11、 收集各種數據庫登錄的來自11種生物的19個piggyBac類似因子的氨基酸序列,利用CLUSTALX1.8和MEGA3.1構建親緣關系樹,進行系統(tǒng)進化分析。結果顯示,雖然已有的piggyBac轉座酶大致歸為三個大的類群(CladeⅠ,CladeⅡ,CladeⅢ)。但除了CladeⅠ全為來自昆蟲的piggyBac類似因子(包括HaPLE1)外,CladeII和CladeIII中既有昆蟲的piggyBac因子又有哺乳動物的piggyBac

12、因子,根據piggyBac因子相似性得出的物種之間的親緣關系嚴重背離了宿主之間實際的親緣關系。由此證實了piggyBac轉座子在進化的過程中并不僅僅進行垂直遺傳,也存在水平轉移。此外,親緣關系樹研究還發(fā)現,來自同一物種的不同轉座子,可以歸為不同的類型,表明不同類型的piggyBac可以反復感染同一種群。 6 棉鈴蟲piggyBac在果蠅卵中的轉座活性研究 將從棉鈴蟲基因組中克隆到的兩個piggyBac因子HaPLE1和H

13、aPLE2分別構建成p3E1.2-CBW-1,p3E1.2-CBW-2兩個質粒,通過電穿孔儀將質粒導入果蠅的胚胎,隨后回收質粒,檢測棉鈴蟲的2個piggyBac轉座子在果蠅中的轉座活性。結果發(fā)現HaPLE2構建的質粒在果蠅卵中沒有剪切發(fā)生,但HaPLE1構建的質粒具有0.00025％的剪切頻率,不過觀察到的剪切位點均不是piggyBac轉座子的經典剪切位點TTAA。由此認為,棉鈴蟲基因組中克隆到的piggyBac因子HaPLE1可能具有