棉鈴蟲抗藥性相關P450基因側翼序列分離與轉座子插入鑒定.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)是世界性的重要經(jīng)濟害蟲，細胞色素P450是生物體中一類重要的代謝酶類，昆蟲P450介導的代謝解毒作用增強是昆蟲對多種殺蟲劑產生抗性的重要機制。最近的研究表明，轉座子插入是P450基因過表達的一個重要機制。本文利用基因組步移獲得棉鈴蟲多個抗性相關P450基因的基因組5'和3'側翼序列，利用生物信息學和分子生物學方法從棉鈴蟲基因組中鑒定了3種新型SINE反轉錄轉座子多個拷貝序列，其

2、中HaSE1和HaSE2是tRNA衍生SINE轉座子，HaSE3是5SrRNA衍生SINE轉座子。研究結果對于明確昆蟲P450基因的進化適應以及昆蟲SINE轉座子的分子進化具有重要意義。
　　 根據(jù)已經(jīng)報道的棉鈴蟲抗藥性相關P450基因CYP9A12、CYP9A14和CYP6AE12以及棉鈴蟲近緣種HelicoverpaZea抗藥性相關CYP321A1基因的cDNA序列，通過genomewalking獲得了多個P450基因5'和

3、/或3'側翼基因組序列，發(fā)現(xiàn)CYP6AE12基因、CYP9A14基因和CYP321A1基因的5'側翼序列存在GATA-1、Oct-1、C/EBP、BR-CZ、CdxA和HSF等多種轉錄因子結合位點。這些轉錄因子可能在特異性調控抗性相關P450基因的表達中具有一定的作用。此外，在棉鈴蟲CYP6AE12基因5'側翼序列和3'側翼序列分別發(fā)現(xiàn)一個Helitron類轉座子Lep1和一個SINE反轉錄轉座子HaSE1.1的插入。
　　 對

4、棉鈴蟲CYP6AE12基因的基因組5'側翼序列的分析發(fā)現(xiàn)了一個新的P450基因，進一步通過RT-PCR獲得了棉鈴蟲一個新的CYP6家族P450基因的1730bpcDNA序列，編碼521個氨基酸，預測蛋白質分子量為14.35kD，等電點為4.98。該基因與CYP6AE12基因在氨基酸水平上具有74％的一致性。
　　 以通過基因組步移獲得的棉鈴蟲CYP6AE12基因的基因組3'側翼序列作為信息探針，應用blastn鑒定獲得21個全長

5、HaSE1拷貝序列，命名為HaSE1.2-HaSE1.22。對所有鑒定的全長HaSE1拷貝的序列分析發(fā)現(xiàn)，這些序列都具有典型的tRNA衍生SINE轉座子的結構特征:側翼為5-18bp的靶標位點重復(targetsiteduplication，TSD);5'端為具有Abox和Bbox（RNA聚合酶Ⅲ啟動子特征性基序）的tRNA相關區(qū);3'末端具有完整或者不完整的TGA重復。利用ClustalW進行多重序列比對獲得的HaSE1一致序列長38

6、6bp，包括與黑腹果蠅tRNAArg（GenBank登錄號:V00243）具有58％同源性的74bp的tRNA相關區(qū)。序列對比發(fā)現(xiàn)，HaSE1一致序列3'末端43bp序列與從棉鈴蟲BAC克?。℅enBank登錄號:FP340435;位置:64987-66631）中鑒定的LINE轉座子HaRTE1.1的3'末端具有82％的同源性。HaRTE1.1長1645bp，側翼為15bp的靶標位點重復(TSD)，編碼的反轉錄酶氨基酸序列與家蠶RTE-

7、3-BM具有42％的一致性，3'非翻譯區(qū)末端為TGA重復。
　　 以HaSE1的74bp的tRNA相關區(qū)作為信息探針，應用blastn鑒定獲得7個HaSE2拷貝序列，命名為HaSE2.1-HaSE2.7。HaSE2的一致序列長286bp，5'端132bp序列與HaSE1具有94％的序列一致性，包括70bp的tRNA相關區(qū)和62bp的保守性中央?yún)^(qū)。值得注意的是，HaSE2一致序列154bp的3'端與從棉鈴蟲中分離的mariner類

8、轉座子Hamar1.3具有98％的序列同源性。這是第一次報道關于一個SINE家族的3'端由DNA轉座子衍生而來。這很可能是由于HaSE2的反轉錄產物整合到mariner轉座子的基因組拷貝中，也有可能是模板轉換(templateswitching)過程中由于tRNA和mariner轉座子的轉錄產物發(fā)生重組造成。
　　 應用blastn和PCR從棉鈴蟲基因組中鑒定和分離獲得16個HaSE3拷貝，命名為HaSE3.1-HaSE3.16

9、。序列比對表明，HaSE3的一致序列的3'端與HaSE1的一致序列的3'端具有94％的序列同源性，表明該HaSE3家族可能來源于反轉座cDNA合成過程中tRNA衍生HaSE1的RNA與5SrRNA的模板轉換。因此，本文的研究首次發(fā)現(xiàn)了昆蟲的一個5SrRNA衍生SINE家族來源于5SrRNA和tRNA衍生SINE的重組。
　　 對GenBank數(shù)據(jù)庫的同源檢索發(fā)現(xiàn)，HaSE1存在于棉鈴蟲的兩個近緣種美洲棉鈴蟲和煙芽夜蛾中。同樣，H