對(duì)蝦細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移技術(shù)研究以及對(duì)蝦早期胚胎microRNAs的挖掘.pdf

1、對(duì)蝦病毒病的頻繁爆發(fā)已對(duì)世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在體外建立永生性對(duì)蝦細(xì)胞系對(duì)于研究對(duì)蝦病毒的侵染機(jī)制以及制備有效的抗病毒藥物或疫苗具有十分重要的意義。將永生性轉(zhuǎn)化因子導(dǎo)入對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞是建立永生性對(duì)蝦細(xì)胞系的一種有效手段。但是由于體外培養(yǎng)對(duì)蝦細(xì)胞不分裂并且難以被轉(zhuǎn)染等問(wèn)題，對(duì)蝦永生性細(xì)胞系一直未獲成功。因此，急需建立和完善適用于對(duì)蝦細(xì)胞的有效的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。目前，對(duì)蝦的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已有了初步的嘗試，所用表達(dá)載體分為非病毒和

2、病毒兩種。這些方法均存在較大的缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)為高致死率和低轉(zhuǎn)化率。
　　本文擬(1)克隆對(duì)蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因（TCTP）的啟動(dòng)子(Ptctp)和對(duì)蝦白斑病毒(WSSV)早期基因ie1的啟動(dòng)子(Pie1)，并將其分別插入病毒和非病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)比較它們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞、魚(yú)類細(xì)胞和對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的活性，從而尋找適用于對(duì)蝦細(xì)胞的高效啟動(dòng)子。(2)將SV40增強(qiáng)子序列插入上述表達(dá)載體

3、中，研究其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中促進(jìn)質(zhì)粒入核的作用，以尋找適用于不分裂的對(duì)蝦培養(yǎng)細(xì)胞的促進(jìn)外源基因表達(dá)的增強(qiáng)子。(3)為了提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對(duì)對(duì)蝦細(xì)胞的侵染偏好性，本文擬克隆對(duì)蝦白斑病毒W(wǎng)SSV的兩種主要囊膜蛋白基因:vp19和vp28，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并通過(guò)共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞的方法，將其引入所包裝病毒顆粒的囊膜上，以期提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性。(4)由于非編碼microRNAs在控制細(xì)胞分裂和

4、細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，因此，本文擬通過(guò)生物信息學(xué)方法，從對(duì)蝦早期胚胎轉(zhuǎn)錄組序列中預(yù)測(cè)可能的microRNAs及其靶基因，從而對(duì)調(diào)控對(duì)蝦胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期的相關(guān)microRNAs進(jìn)行挖掘。
　　在對(duì)蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因啟動(dòng)子Ptctp的活性研究方面，我們成功克隆了刀額新對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因的啟動(dòng)子序列，分別命名為Pme-tctp和Pmj-tctp，長(zhǎng)度為612 bp，并利用軟件TFsearch和Match對(duì)其

5、可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。同時(shí)，成功克隆了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的編碼框序列，然后以pMCs-GFP為基本質(zhì)粒（含啟動(dòng)子PLTR），利用雙酶切反應(yīng)將上述2種啟動(dòng)子分別定向插入該質(zhì)粒啟動(dòng)子(5' LTR)之后，綠色熒光蛋白基因(GFP)或eGFP序列之前，或以eGFP基因替換GFP基因，從而構(gòu)建了以下五種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，分別為:單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP以及雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-Pme-

6、tctp-GFP、 pMCs-PLTR-Pmj-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pMCs-PLTR-Pmj-tctp-eGFP。通過(guò)脂質(zhì)體法將上述五種載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞Plat-GP后，在熒光顯微鏡下均可檢測(cè)到明顯的綠色熒光信號(hào)。與雙啟動(dòng)子質(zhì)粒相比，單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP介導(dǎo)的綠色熒光表達(dá)效率和強(qiáng)度均最大，這表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中LTR啟動(dòng)子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起主要作用，而Pme-t

7、ctp和Pmj-tctp的插入對(duì)LTR啟動(dòng)子啟動(dòng)下游報(bào)告基因的的表達(dá)造成了一定的影響。通過(guò)脂質(zhì)體法將上述五種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染刀額新對(duì)蝦Oka器官原代培養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)，單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，而其他4種雙啟動(dòng)子質(zhì)粒均可檢測(cè)到綠色熒光，這表明雙啟動(dòng)子表達(dá)載體可在對(duì)蝦細(xì)胞中有效啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PCR和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也表明，脂質(zhì)體法可以把表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入對(duì)蝦細(xì)胞中，但單啟動(dòng)子質(zhì)粒不能被轉(zhuǎn)錄

8、表達(dá)，雙啟動(dòng)子質(zhì)粒則可以被轉(zhuǎn)錄表達(dá)出mRNA，這與熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果一致。
　　在提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性方面，我們成功克隆得到了對(duì)蝦WSSV兩種囊膜蛋白VP19和VP28的基因編碼框序列，長(zhǎng)度分別為366 bp和615 bp，分別編碼121和204個(gè)氨基酸。將其定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA，成功構(gòu)建了pcDNA-VP19和pcDNA-VP28兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)共轉(zhuǎn)染不同組合的包

9、裝質(zhì)粒與病毒報(bào)告質(zhì)粒到包裝細(xì)胞Plat-GP中:(1)pMCs-PLTR-eGFP和 pCMV-VSV-G;(2) pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pCMV-VSV-G;(3)pMCs-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和pcDNA-VP28;(4)pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和PcDNA-VP28,進(jìn)行病毒包裝、滴度測(cè)定和對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞感

10、染，以比較該系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性上的變化。結(jié)果表明，所包裝病毒的滴度可達(dá)到(1.9-2.1)×108 TU/ml。包裝病毒侵染對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，沒(méi)有共轉(zhuǎn)染對(duì)蝦WSSV囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的包裝病毒顆粒以及單啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體所包裝的病毒顆粒所感染對(duì)蝦細(xì)胞中均未觀察到綠色熒光表達(dá)。只有共轉(zhuǎn)染組合(4)包裝而形成的病毒顆粒，才能成功介導(dǎo)報(bào)告基因在對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，雖然只檢測(cè)到較少的陽(yáng)性克

11、隆，且熒光強(qiáng)度較弱，但這一結(jié)果表明，將對(duì)蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19引入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可明顯提高該系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性，雖然效率不高。
　　為了探討對(duì)蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19在提高逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性上的作用機(jī)理，本文利用DAS、Topred2、Tmpred以及HMMTOP四種軟件對(duì)VP19和VP28蛋白的疏水性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)VP19中第36-55和第95-114個(gè)氨基酸之間，VP28中

12、第7-27個(gè)氨基酸之間為可能的跨膜結(jié)構(gòu)域。為驗(yàn)證包裝細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的VP19和VP28蛋白是否能定位于質(zhì)膜上，本文分別將eGFP和mCherry基因定向插入到去終止密碼子的vp19和vp28基因序列的C-端，構(gòu)建了兩種融合蛋白表達(dá)載體:pcDNA-VP19-ΔTAA/eGFP（綠色熒光標(biāo)記VP19蛋白）和pcDNA-VP28-ΔTAA/mCherry（紅色熒光標(biāo)記VP28蛋白）。利用脂質(zhì)體法將以上兩種融合蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入Plat-GP細(xì)胞

13、中，過(guò)表達(dá)48小時(shí)后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成功觀察到過(guò)表達(dá)的VP19和VP28蛋白定位于細(xì)胞膜上。這表明本文改造過(guò)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)系統(tǒng)的嗜對(duì)蝦細(xì)胞性與對(duì)蝦WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有關(guān)。
　　在對(duì)蝦早期胚胎的microRNAs挖掘方面，本文又以Illumina平臺(tái)獲得的對(duì)蝦早期胚胎轉(zhuǎn)錄組序列為參考，利用BlastN與RNAfold分別進(jìn)行同源比對(duì)分析以及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，最終獲得了21條保守的miRNAs序列，分別屬

14、于19個(gè)miRNAs家族，分別為mja-miR-14、44、242、287、317、927、966、969、1014、1175、2491、2731、2774、2788、3338、3885、4961、6489和6493。為驗(yàn)證所預(yù)測(cè)的對(duì)蝦miRNAs的真實(shí)性，并比較其在不同發(fā)育時(shí)期的miRNAs的表達(dá)模式，我們進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR技術(shù)分析了這些miRNAs在對(duì)蝦原腸胚時(shí)期和無(wú)節(jié)幼體時(shí)期的miRNAs表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)，只有其中的15條mi

15、RNAs成功擴(kuò)增得到了陽(yáng)性條帶;原腸胚時(shí)期的miRNAs表達(dá)水平與無(wú)節(jié)幼體時(shí)期呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式;其中mja-miR-3885在兩個(gè)發(fā)育時(shí)期均具有極高的表達(dá)量，表明該miRNAs在對(duì)蝦胚胎的發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用。
　　靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，以轉(zhuǎn)錄組中所有unigene作為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)miRanda算法和一套嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，最終得到了120個(gè)靶基因序列。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明

16、所有的靶基因在細(xì)胞組分上分為11個(gè)類別，在分子功能上分為10個(gè)類別，在生物學(xué)功能上分為18個(gè)類別。其中19個(gè)靶基因涉及31個(gè)代謝通路，主要的代謝途徑有:RNA降解途徑、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞周期以及礦物質(zhì)吸收等，這些對(duì)胚胎發(fā)育均具有重要作用。在靶基因預(yù)測(cè)的過(guò)程中，11個(gè)靶基因被注釋與對(duì)蝦胚胎的發(fā)育行為和免疫有關(guān)。本文還對(duì)其中的七個(gè)基因進(jìn)行了RPKM值統(tǒng)計(jì)以及RT-qPCR表達(dá)豐度分析。上述miRNAs及其靶基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式結(jié)果

17、提示我們，對(duì)蝦也具有一個(gè)復(fù)雜的miRNA: mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用于精準(zhǔn)調(diào)控其胚胎發(fā)育過(guò)程。
　　總之，本文對(duì)對(duì)蝦TCTP基因啟動(dòng)子(Ptctp)和WSSV早期基因ie1啟動(dòng)子(Pie1)在對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中的活性以及SV40增強(qiáng)子序列在對(duì)蝦細(xì)胞中的DTSs活性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動(dòng)子均能介導(dǎo)外源基因在對(duì)蝦細(xì)胞中的表達(dá)，雖然表達(dá)效率還不高。SV40能夠明顯提高動(dòng)物細(xì)胞中載體的入核效率。本文還在此基礎(chǔ)上建立了一套嗜對(duì)蝦細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)