濾泡輔助性T細胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中的作用研究.pdf

1、目的:濾泡輔助性T細胞(FollicularTHelpercells,Tfh細胞)是一類全新的T細胞亞群,Tfh細胞在B細胞的發(fā)育、生發(fā)中心的形成、抗體類別轉(zhuǎn)換,建立長期體液免疫應(yīng)答等過程中扮演主要角色。本研究利用表達口蹄疫病毒VP1基因的重組腺病毒疫苗(rAd5VP1)免疫小鼠,通過觀察小鼠脾臟中濾泡輔助性T細胞(Tfollicularhelpercells,Tfh)的分化、生發(fā)中心(GC)的形成、Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA

2、的表示水平及Tfh細胞主要細胞因子白細胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的分泌水平,探討Tfh細胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用。
　　方法:6周齡BALB/c小鼠,隨機分為兩組,每組10只。實驗組免疫rAd5VP1,對照組注射PBS。
　　1.免疫后7d,取小鼠脾臟,分離單個核細胞,通過流式細胞術(shù)(FCM)檢測Tfh細胞(CD4+CXCR5+PD-1+)的分化、生發(fā)中心B細胞(B220+

3、GL-7+)的分化;分析CXCR5+T細胞/CD4+T細胞的比例、CXCR5+PD-1+T細胞/CD4+T細胞的比例、GL-7+B細胞/B220+B細胞的比例。
　　2.免疫后7d,取小鼠脾臟,分離單個核細胞,通過real-timeRT-PCR技術(shù)檢測Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表達水平。
　　3.免疫后7d,取小鼠脾臟,常規(guī)方法制作石蠟切片,經(jīng)FITC-花生凝集素(PeanutAgglutinin,PNA)染色,

4、免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。
　　4.免疫后7d,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒檢測小鼠血清中Tfh細胞分泌細胞因子IL-21的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)小鼠Tfh細胞的分化,而且,單個核細胞中CXCR5+T細胞/CD4+T細胞的比例(4.05±0.10)明顯高于PBS對照組(2.14

5、±0.29),P=0.007.**P<0.01;單個核細胞中CXCR5+PD-1+T細胞/CD4+T細胞的比例(1.17±0.17)明顯高于PBS對照組(0.69±0.17),P=0.03.*P<0.05;
　　2.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,單個核細胞中GL-7+B細胞/B220+B細胞的比例(3.66±0.53)明顯高于PBS對照組(1.74±0.05),P=0.02.*P<0.05;

6、
　　3.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,real-timeRT-PCR檢測BCL-6mRNA的相對表達水平得到CT值,進行相對定量處理得到2–ΔΔCT值,再行統(tǒng)計分析得到疫苗rAd5VP1免疫組中BCL-6mRNA表達量是對照組表達量的2.39倍。P=0.001.**P<0.01。
　　4.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,分離血清,ELISA試劑盒檢測血清中IL-21分泌水平,結(jié)果顯示,rAd5

7、VP1實驗組中IL-21表達量(63.68±13.15,pg/ml)明顯高于PBS對照組表達量(4.65±2.36,pg/ml),P=0.02.*P<0.05。
　　5.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,常規(guī)方法制作石蠟切片,經(jīng)FITC-PNA染色,免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。結(jié)果顯示,重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)生發(fā)中心的形成,經(jīng)ImageJ軟件分析平均熒光密度數(shù)值,統(tǒng)計得出,rAd5VP1組表達量(12

8、.54±1.77)明顯高于PBS對照組表達量PBS(6.71±0.55),P=0.00001.**P<0.01。
　　結(jié)論:利用口蹄疫重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,重組腺病毒疫苗能誘導(dǎo)Tfh細胞的分化、促進GC的形成及促進GCB細胞的分化、提高Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表示水平,及增強Tfh細胞主要細胞因子IL-21的分泌水平。結(jié)果顯示,在口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答中,Tfh細胞及其效應(yīng)分子都