miR-130a與miR-212在HepG2和HepG2-Adr中表達差異鑒定.pdf

1、背景及目的:
　　肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現逐年上升趨勢，且致死率極高。全身化療作為中晚期肝癌患者的重要治療手段之一，其療效并不理想，主要原因是肝癌的多藥耐藥。肝癌多藥耐藥的機制復雜，目前研究認為其主要機制包括膜轉運蛋白介導的藥物外排，凋亡調控基因介導的細胞凋亡，各類酶介導的耐藥等。其中膜轉運蛋白介導的肝癌多藥耐藥機制是最重要的機制。ABC轉運蛋白中的P-gp蛋白在肝癌組織中高表達，且在耐藥細胞中這種高表達更為

2、明顯。ABCG2蛋白的表達則與藥物環(huán)境有關，在藥物環(huán)境中，其表達增加，可以加速肝癌細胞內藥物的外排，因此P-gp和ABCG2蛋白在肝癌膜轉運蛋白介導的藥物外排泵機制中起重要作用。miRNA是一種由21-25個核苷酸組成的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一類在進化上高度保守的不編碼蛋白質的短序列RNA，參與轉錄后水平的調節(jié)，并對細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程進行調控，與人類多種疾病相關。目前大量研究表明miRNA作為抑癌基

3、因或癌基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關系。有報道顯示miR-130a和miR-212通過不同的機制參與了多種腫瘤的多藥耐藥，但與肝癌的相關報道少見，且很多機制尚不明確。因此本研究以HepG2細胞和HepG2/Adr細胞（阿霉素耐藥HepG2細胞）為對象，采用miRNA芯片技術尋找與肝癌耐藥膜蛋白相關的差異miRNA，并通過qPCR技術對候選的差異表達的miRNA進行驗證，旨在深入地了解有哪些miRNA可能參與了對肝癌耐藥蛋白及編碼基因的調

4、控，為后續(xù)對篩選出來的miRNA進行功能學檢測提供研究基礎。該研究將進一步揭示肝癌耐藥機制，有助于為提高肝癌的綜合治療療效尋找到一條新途徑。
　　方法:
　　1.運用MTT法對HepG2與HepG2/Adr細胞對阿霉素的耐藥性差異進行檢測
　　2.運用Exiqon miRNA表達譜芯片技術檢測3100條人，小鼠，大鼠三物種全部miRNA以及上述三物種相關的所有病毒的miRNA以及25個miRPlusTM人miRNA在H

5、epG2與HepG2/Adr細胞內的表達水平差異，應用分層聚類分析獲得差異表達的miRNA譜，并根據相關文獻報道選擇miR-130a和miR-212作為候選miRNA。
　　3.運用qPCR技術對HepG2與HepG2/Adr細胞中MDR1，ABCG2，miR-130a，miR-212基因表達進行檢測，qPCR結果采用2-ΔΔCt法進行分析。
　　4.實驗數據均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。實驗數據用均數±標準差表示，使

6、用單因素方差分析及t檢驗來比較組間差異，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　1.HepG2/Adr細胞對阿霉素的耐藥指數是HepG2細胞的2.968倍，HepG2/Adr細胞對ADM具有更強的耐藥性。
　　2.miRNA芯片檢測結果表明存在HepG2/Adr特異性的miRNA譜，共篩選出236個差異表達的miRNA，其中118個miRNA上調，118個miRNA下調。納入標準為上調和下調均超過2倍。mi

7、R-130a和miR-212在耐藥株和非耐藥株中存在明顯差異。
　　3.通過qPCR法檢測我們發(fā)現，在HepG2中MDR1基因相對表達量是在HepG2/Adr中的0.094倍(P＜0.05);在HepG2中ABCG2基因相對表達量是在HepG2/Adr中的0.47倍(P＜0.05);在HepG2中miR-130a基因相對表達量是在HepG2/Adr中的4.057倍(P＜0.05);在HepG2中miR-212基因相對表達量是在He

8、pG2/Adr中的5.434倍(P＜0.05)，結果均具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.HepG2/Adr具有特異性的miRNA表達譜，這些特異性的miRNA可能參與了肝癌多藥耐藥的調控。
　　2.MDR1和ABCG2在HepG2/Adr株中上調，MDR1和ABCG2可能共同參與了肝癌膜蛋白介導的多藥耐藥機制。
　　3.miR-130a和miR-212在HepG2/Adr細胞株中下調，兩者是否參與肝癌膜蛋白的