Real-time PCR檢測弓形蟲方法學的建立及初步應用.pdf

1、 本文目的是建立實時熒光定量PCR檢測弓形蟲的方法，并將此方法應用于臨床標本的檢測，以期為弓形蟲的早期診斷和治療療效的監(jiān)測提供可靠的實驗室依據(jù)。方法：1.根據(jù)弓形蟲RH株529bp重復片斷段，設計并合成引物和TaqMan-MGB探針；將PCR擴增的特異片段克隆入T載體，并轉化入大腸桿菌DH5 α中。2.重組質粒經(jīng)篩選、鑒定后，作為陽性模板用于Real-time PCR的建立，包括PCR反應條件的優(yōu)化，標準曲線的制備以及敏感性、特異

2、性、重復性的方法學評價。3.將建立的Real-time PCR用于臨床婦女血液標本弓形蟲的檢測，其結果與巢式PCR和ELISA的結果相比較。結果：1.確立了Real-time PCR最佳反應條件。2.應用定量陽性重組質粒制作的標準曲線其循環(huán)閾值與起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值之間具有良好的線形關系，相關系數(shù)大于99﹪，試驗內和試驗間變異系數(shù)均小于5﹪，無非特異性擴增，與普通PCR相比，該方法更加靈敏、簡便、快速。3.對臨床標本的檢測結果顯示，R