CHFR和Runx3基因表達及啟動子甲基化與胃癌病理生物學特征的關系及機制研究.pdf

1、目的： 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。與其他惡性腫瘤一樣，胃癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程。這些基因主要是癌基因、抑癌基因及DNA錯配修復基因等。抑癌基因功能的丟失可以通過多種途徑，除基因突變和雜合性丟失外還與其啟動子發(fā)生甲基化修飾有關。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化下，以S-腺苷蛋氨酸(Sademetionine，SAM)為甲基供體，將甲基轉移

2、到DNA特定堿基上去的過程。真核生物染色體DNA甲基化是基因表達調控的一種方式。DNA異常甲基化可引起染色體結構、DNA穩(wěn)定性的改變和基因表達異常，影響細胞的增殖和分化。真核生物DNA甲基化水平與腫瘤關系密切。啟動子區(qū)高甲基化能導致抑癌基因表達沉默，這是腫瘤發(fā)生的關鍵事件。新近研究證實，CHFR是重要的腫瘤抑制基因，其表達產物是Plk1的泛素化連接酶。Plk1調控cdc25和Weel激酶的磷酸化，在G2期進入M期時控制cdc2激酶的活性

3、。而CHFR能引起Plk1泛素化和降解，阻斷細胞進入有絲分裂中前期。CHFR基因在人正常組織中普遍表達，在一些腫瘤中表現為失活或低表達，因而不能阻斷異常細胞通過G2期進入有絲分裂中前期，從而導致細胞的惡性增殖。另有研究證實，Runx3基因(runt-related transcription factor 3 gene)編碼的runx3蛋白是TGF-β信號通路下游的一個轉錄調節(jié)因子，TGF-β是多種細胞生長的有效抑制因子，TGF-β信號

4、轉導通路的紊亂可導致多種腫瘤的發(fā)生。 本研究采用MSP、RT-PCR、Westernblotting及免疫組化(IHC)技術，檢測人胃癌組織及其配對正常胃黏膜CHFR及Runx3基因的甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白的表達水平，觀察分析CHFR及Runx3基因異常甲基化與其mRNA表達水平和蛋白表達的關系，探討胃癌組織中CHFR及Runx3基因啟動子甲基化和mRNA表達異常與胃癌病理生物學特征的關系，為闡釋抑癌基因CHFR及Runx3

5、在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機理提供新的科學實驗依據。 實驗材料和方法： 1、研究對象 本實驗研究對象收集2003-12至2004-05中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科及遼寧省腫瘤醫(yī)院外科手術切除胃癌常規(guī)病理組織標本151例。另外，收集2007年3月至9月遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤外科手術切除之新鮮胃癌組織及其配對遠端的正常胃粘膜組織(距胃癌灶邊緣>5cm處)標本共36例，迅速置于液氮內冷凍，然后儲存于-70℃冰箱中保存

6、待用。所有病例均經病理檢查確定診斷，所有胃癌患者術前均未經化療和放療。選擇胃癌和其配對正常胃粘膜組織資料完整的20個病例用于實驗。 2、實驗方法 (1)胃癌組織芯片制作 采用組織芯片制作儀(Microarrayer，BeecherInstruments，USA)制作組織芯片。構建完成胃癌及其癌前病變的組織微陣列石蠟塊1、2、3、4和5(蠟塊1：含117個組織芯；蠟塊2：含109個組織芯；蠟塊3：含110個組織芯；

7、蠟塊4：含101個組織芯；蠟塊5：含124個組織芯)。將組織芯片蠟塊行連續(xù)切片，切片厚度為4μm，用于免疫組織化學染色的切片裱于經0.1％多聚賴氨酸防脫片處理的載玻片上，60℃烤片1h，58℃中繼續(xù)烤片18h，常溫保存?zhèn)溆谩?(2)免疫組化染色檢測CHFR和mP53蛋白表達 采用Envision方法對胃癌及其癌前病變組織芯片進行免疫組化染色。Immuno-Bridge＋試劑盒，鼠抗人CHFR單克隆抗體(工作濃度1:75)

8、和鼠抗人：P53單克隆抗體(即用型)分別購自Abnova公司和北京中杉金橋生物技術有限公司。所有步驟依據產品說明書進行，利用PBS(0.01mol/L，PH7.4)替代一抗作為陰性對照。 免疫組化染色結果判定：CHFR和mP53蛋白免疫染色陽性信號分別定位于細胞漿和胞核，呈棕黃色顆粒，每個標本觀察2個有代表性的高倍視野，每個視野計數100個細胞確定陽性細胞數所占的百分比并取它們的平均值，陽性細胞數≤20％為陰性(-)，陽性細胞數

9、>20％為陽性(+)。 (3)RT-PCR法檢測CHFR和Runx3基因mRNA表達 采用TRIZOL試劑提取標本總RNA，將總RNA反轉錄成cDNA，然后以CHFR和Runx3基因引物進行PCR擴增，以β-actinPCR為內參照。 (4)MSP檢測CHFR和Runx3基因甲基化狀態(tài) 采用TIANampGenomic血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA。先用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，純

10、化DNA后，使用CHFR和Runx3基因甲基化及非甲基化引物進行擴增。 (5)WesternBlot檢測CHFR和Runx3基因編碼蛋白表達 組織以1:5比例加入裂解緩沖液提取組織蛋白；樣品(蛋白)濃度的定量采用考馬斯亮藍法；蛋白質進行12％濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；硝酸纖維素濾膜，轉膜2h；與一抗(CHFR工作濃度1:400，Runx3工作濃度1:300)室溫下孵育2h；辣根過氧化物酶標記的二抗(工作濃度1:10

11、00)室溫孵育1h；免疫印跡化學發(fā)光試劑(ECLReagent)顯示免疫反應條帶；采用GEL-XR凝膠成像系統(tǒng)將將電泳結果成像；BANDSCAN5.0軟件系統(tǒng)采集數據，采用目的蛋白條帶光密度值與相應β-tubulin光密度值的比值作為相對表達水平指標，進行統(tǒng)計學分析。 3、統(tǒng)計學分析 數據用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，組內資料以構成比描述，組間計數資料采用x2檢驗(Fisher’精確概率法)和

12、計量資料t檢驗，Spearman等級相關檢查。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。 結論： 1、151例胃癌組織中CHFR基因編碼蛋白表達結果顯示，有絲分裂前期檢查點CHFR基因表達下調或缺失在胃癌中是頻發(fā)事件。可能參與胃癌的發(fā)生，其與女性、彌漫浸潤型胃癌發(fā)生發(fā)展的關系可能更為密切。 2、CHFR和Runx3基因在胃癌組織中的甲基化率均顯著高于其配對正常胃粘膜，提示CHFR和Run

13、x3基因異常甲基化可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展；胃癌組織中CHFR和Runx3基因啟動子甲基化是其mRNA及編碼蛋白表達下調或缺失的主要原因。對二者的檢測可有助于胃癌的早期診斷。 3、胃癌組織中CHFR與Runx3mRNA異常表達無密切相關關系，但均與組織學分化程度有關，二者可能通過不同作用機制參與胃癌的組織學分化。Runx3mRNA表達下調或缺失與胃癌的侵襲深度及淋巴結轉移密切相關，對客觀判斷胃癌患者預后，指導臨床治療具有重要意義。