偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失轉移質粒的構建.pdf

1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies viurs，PRV）屬皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科（Alpha-herpesviridae），可致多數動物感染發(fā)病，并能引起豬的潛伏感染。豬是其主要宿主和病毒攜帶者，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害重大。在2011年之前，由于PRV gE缺失疫苗的廣泛使用，國內的PRV疫情得到了很好的控制，但從2011年底開始，PRV疫情突然大面積爆發(fā)，傳統(tǒng)的gE缺失疫苗已被證實無法提供完全有效的

2、免疫保護，使得國內養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大的威脅。本研究對 PRV新流行毒株進行了分離鑒定，并對其主要糖蛋白的分子特征進行了分析；模仿 PRV Bartha株的gE缺失區(qū)域，構建了PRV新流行毒株的gE缺失轉移質粒，為新流行毒株gE缺失突變株的構建奠定了基礎。具體研究內容如下：
　　1、偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定
　　從安徽某免疫PRVBartha K61疫苗豬場送檢的流產胎兒中采集腦、心、肝、脾、肺、腎，經 PCR擴增，結果從腦

3、、肝、脾、肺中檢測到PRV gE基因陽性。將腦組織研磨后接種BHK-21細胞，在37℃5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，細胞出現了明顯的細胞病變，病變細胞經 PCR檢測為 PRV gE陽性；采用空斑純化方法純化了該病毒，并命名為PRV AH-China-2013。將病毒接種昆明小鼠，通過LD50測定評價了該病毒對小鼠的致病性，結果表明其LD50為104.15TCID50。
　　2、偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

4、　　提取PRV AH-China-2013基因組，采用PCR擴增其主要糖蛋白基因gB、gC、gD、gE，經測序后，將gC、gE基因分別與國內外不同年代分離的PRV毒株進行序列比對，通過mega5.0繪制PRV AH-China-2013株gC和gE基因的遺傳進化樹；通過PRV AH-China-2013gB、gC、gD、gE序列推導其氨基酸序列，并與國內外不同年代分離的PRV毒株相應糖蛋白序列進行比對分析。遺傳進化分析結果顯示，PRV

5、AH-China-2013株與國內毒株（除2008年分離的7株毒株外）位于同一個分支，且與2011年來新分離毒株的遺傳關系更近，而與與國外毒株及疫苗毒株Bartha株遺傳關系較遠，表明PRV AH-China-2013株屬于PRV新流行毒株。氨基酸序列比對結果顯示，與國外毒株相比，國內株主要糖蛋白均存在明顯的氨基酸的缺失或插入，且部分突變位點位于相應蛋白的關鍵功能域內，這些突變是否導致病毒毒力及免疫原性的改變，進而影響現有疫苗的免疫效果

6、，尚需進一步證實。
　　3、偽狂犬病病毒新流行株gE缺失轉移質粒的構建
　　根據新流行毒株 PRV-ZJ01的基因組序列，在 gE基因上、下游設計長度分別為838bp和961bp的基因片段作為同源重組的同源臂，即同源左臂 LA和同源右臂 RA；以 pEGFP質粒為模板，設計引物擴增包含完整表達盒的綠色熒光蛋白基因 EGFP作為標記基因。通過酶切、連接、轉化等方法，并按照 LA-EGFP-RA的順序，將 LA、RA、EGFP連

7、接到T載體的多克隆位點，構建PRV gE缺失轉移質粒，經測序正確的質粒命名為 pMD-LA-EGFP-RA。將構建好的轉移質粒 pMD-LA-EGFP-RA轉染BHK-21細胞，通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示轉染細胞中可觀察到綠色熒光蛋白EGFP的表達，表明構建的轉移質?？梢杂糜诤罄m(xù)同源重組試驗。
　　本研究從分子水平上解析了PRV新流行株與疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遺傳差異，為進一步深入研究 Bartha株疫苗免疫失敗的原因