大鼠尺神經和肌皮神經再生時神經纖維代償性放大規(guī)律的比較研究.pdf

1、臨床發(fā)現，尺神經重建手術效果不如肌皮神經，在供體神經纖維數量不足時更加明顯。有研究發(fā)現，不同神經在供體神經纖維不足時，其神經纖維代償性放大潛能不同。因此，我們假設尺神經纖維的放大潛能不如肌皮神經。本課題將通過研究尺、肌皮神經在其再生過程中神經代償性放大效應差異及其影響因素，驗證我們提出的假設，并根據實驗結果從神經再生角度闡釋尺神經重建手術不如肌皮神經的機制。實驗分成三部分:(1)明確大鼠尺、肌皮神經在臂叢神經根的定量分布，其目的是采用穩(wěn)

2、定、可操作性強的方法，減少尺、肌皮神經中的神經纖維數量，從而建立可供研究尺、肌皮神經再生代償性放大潛能差異的大鼠模型。(2)比較大鼠尺、肌皮神經再生時神經纖維代償性放大極限。(3)通過Real-timePCR檢測神經縫合口遠端神經營養(yǎng)因子的表達，分析其表達量與神經纖維再生代償性放大率的關系。
　　第一部分建立研究尺、肌皮神經再生時神經纖維代償性放大極限的大鼠模型
　　目的: 通過True-Blue、Fluo-Emerald、

3、Fluo-Ruby三種熒光劑逆行示蹤，比較三種熒光劑染色的可靠性和穩(wěn)定性。明確支配尺、肌皮神經的神經元在臂叢神經根的分布及支配比例，并采用切斷某些神經根以減少尺、肌皮神經中的神經纖維數量，從而建立可供研究尺、肌皮神經再生代償性放大潛能差異的大鼠模型。
　　方法: 60只成年健康清潔級雌性SD大鼠，體重150-200克，隨機分成6組，每組10只:U-TB組為尺神經True-Blue示蹤組;U-FE組為尺神經Fluo-Emerald示

4、蹤組;U-FR組為尺神經Fluo-Ruby示蹤組。M-TB組為肌皮神經True-Blue示蹤組;M-FE組為肌皮神經Fluo-Emerald示蹤組;M-FR組為肌皮神經Fluo-Ruby示蹤組。分析支配尺神經和肌皮神經的神經元在脊髓的分布和各神經根支配比例，以及三種熒光劑染色定量結果的穩(wěn)定性。每組數據以均數±標準差的形式表示，各組間的差異采用單因素方差分析，統(tǒng)計值設定為0.05。
　　結果: (1) U-TB組:顯示著藍色的神經元

5、位于C7-T1脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為2176±186.51。其中位于C7前角的數量為5.2±2.44個（0～9個），背根神經節(jié)內為31±11.32個;位于C8前角的數量為157±29.8個，背根神經節(jié)內為1203.1±113.71個;位于T1前角的數量為150±21個，背根神經節(jié)內為651.3±78.47。C5、6未見染色神經元。(2) U-FE組:顯示著綠色的神經元位于C7-T1的脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為2268.7

6、±209.57。其中位于C7前角的數量為5.6±2.41個（0～8個），背根神經節(jié)內為34±7.73個;位于C8前角的數量為150±19.9個，背根神經節(jié)內為1305±194.8;位于T1前角的數量為142.4±26.25.個，背根神經節(jié)內為631.2±43.92個。C5、6未見染色神經元。(3) U-FR組:顯示著紅色神經元位于C6-T1節(jié)段脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為2216±211.56。其中位于C6前角的數量為0個，背根神經

7、節(jié)內為0～55個;位于C7前角的數量為4.4±2.22個（2～9個），背根神經節(jié)內為28.6±11.79;位于C8前角的數量為135±23.9，背根神經節(jié)內為1224.5±148.74.個;位于T1前角的數量為153.9±18.19，背根神經節(jié)內為669.7±97.42個。(4) M-TB組:顯示著藍色的神經元位于C4-C7的脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為1871±120.53。其中位于C4前角的數量為0～11個，背根神經節(jié)內為7.8

8、±4.05個;位于C5前角的數量為164±16.97個，背根內為253.3±36.96個;位于C6前角的數量為149±25.8個，背根神經節(jié)內為904.6±104.92;位于C7前角的數量為0～6個，背根神經節(jié)為386.5±28.77個。C8、T1脊髓節(jié)段未見染色神經元。(5) M-FE組:顯示著綠色的神經元位于C5-C7的脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為1937.9±311.22。其中位于C5前角的數量為171.2±49.31個，背根

9、神經節(jié)內為244.4±25.49個;位于C6前角的數量為143±28.6個，背根神經節(jié)內為985.1±257.57;位于C7前角的數量為0～7個，背根神經節(jié)為291.7±51.36個。C4、C8、T1脊髓節(jié)段未見染色神經元。(6) M-FR組:顯示著紅色的神經元位于C4-C8的脊髓前角和相應背根神經節(jié)，總數為1902±212.64。其中位于C4前角的數量為0～12個，背根神經節(jié)內為0～15個;位于C5前角的數量為151.8±18.38個

10、，背根神經節(jié)為240±30.4;位于C6前角的數量為132.7±16.64個，背根神經節(jié)為947±203個;位于C7前角的數量為0～15個，背根神經節(jié)內為412.6±46.94個;位于C8前角的數量為0～2個，背根神經節(jié)內為0～4個。T1脊髓節(jié)段未見染色神經元。(7)本實驗中，在三種不同熒光素染色標記的條件下，尺、肌皮神經在神經根及其背根神經節(jié)的分布及支配比例基本相同(P＞0.05)。以Fulo-emerald示蹤結果為基準，尺神經運動

11、神經元主要位于C8和T1，兩個節(jié)段數量基本相同，無統(tǒng)計學差異;感覺神經元主要位于C7、8和T1，C8節(jié)段數量最多。T1運動、感覺神經元總和約占支配尺神經的神經元總數的34.1％，C7占1.7，％，C8占約64.2％。肌皮神經運動神經元主要位于C5和C6，C5節(jié)段數量稍多;感覺神經元主要位于C5-7，C6節(jié)段數量最多，C7主要含感覺神經元。C5運動、感覺神經元總和占支配肌皮神經的神經元總數的22.1％，C6占62.5％，C7占15.4％。

12、
　　結論: (1)采用切斷C5-8神經根，保留T1神經根，并將尺神經切斷后行自身端-端縫合修復的方法建立大鼠模型，作為以尺神經纖維代償性放大極限的模型是可靠的。(2)采用切斷C6-8、T1神經根，保留C5神經根，并將肌皮神經切斷后行自身端-端縫合修復的方法建立大鼠模型，作為研究肌皮神經纖維代償性放大極限的模型是可靠的。
　　第二部分大鼠尺、肌皮神經再生時神經纖維代償性放大極限的比較研究
　　目的: 通過動態(tài)觀察尺、肌

13、皮神經神經再生過程中神經纖維代償性放大率，比較這兩神經的神經纖維放大極限。
　　方法: 224只成年健康清潔級雌性SD大鼠，體重150～200克，隨機分成神經放大模型16組，每組8只:U-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表尺神經放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周;M-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表肌皮神經放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以對側肢體相應神經為正常對照組。

14、切斷相應神經，設為神經切斷對照組，每組6只。按時間點檢測(1)神經縫合口近、遠端有髓神經纖維數量，計算其放大率;縫合口近、遠端的運動纖維數量，計算其放大率;(2)神經CMAP波幅和潛伏期;(3)神經纖維直徑、軸突直徑、髓鞘厚度、G比率。每組數據以均數±標準差的形式表示，采用單因素方差分析分析各組間的差異，統(tǒng)計值設定為0.05。
　　結果: (1)正常肌皮神經、尺神經纖維總量分別為2135±197和2535±238;運動神經纖維分別

15、為395±47和335±34。(2)尺神經放大模型建立后1周至4周，縫合口近端神經數量依次為653.23±102.71，703.79±84.26，772.40±54.93和593.41±39.36;縫合口遠端神經纖維數量依次為979.72±162.73，972.35±93.30，1124.59±217.27和1980.33±216.53;放大率依次為2.20±0.53，1.41±0.24，1.57±0.39和3.34±0.51;建模后8

16、、12、16和20周，縫合口近端神經纖維數量依次為725.92±132.93，671.80±112.25，553.52±64.71和682.51±107.42，遠端神經纖維數量依次為2217.72±419.84，1677.29±254.92，1844.19±202.90和1953.13±412.17，放大率依次為3.01±0.44，2.76±0.37，3.15±0.46和2.31±0.98。(3)肌皮神經放大模型建立后1周至4周，縫合口

17、近端神經數量依次為352.75±40.31，393.49±59.27，379.81±60.52和350.61±30.58;縫合口遠端神經纖維數量依次為1079.75±242.41，477.36±83.55，453.75±76.59和1434.77±312.93，放大率依次為4.77±1.25，1.21±0.47，1.19±0.32和4.09±0.73;建模后8、12、16和20周，縫合口近端神經纖維數量依次為387.68±52.74，3

18、62.48±33.45，372.07±43.28和363.25±37.42，縫合口遠端神經纖維數量依次1798.60±345.37，1566.19±217.04，1549.96±215.47和1479.31±174.58，放大率依次為4.71±1.32，4.29±0.79，4.23±0.65和4.34±0.49。(4)尺神經運動神經纖維:放大模型建立后1周至4周，縫合口近端運動纖維數量為212.61±43.82，192.43±27.55

19、，200.92±35.27和183.90±27.44，遠端為20.55±7.13，12.38±4.31，19.39±7.30和20.09±7.59，放大比率分別為0.094±0.031，0.057±0.012，0.110±0.031和0.102±0.037。8周、12周、16周和20周的近端運動纖維數量為190.37±25.38，222.61±42.73，208.52±74.75和231.45±77.19，遠端分別為120.59±37.

20、30，219.91±50.48，277.40±47.65和291.80±49.92，放大比率分別為0.72±0.169，1.06±0.242，1.48±0.45和1.45±0.317。(5)肌皮神經運動神經纖維:放大模型建立后1周至4周，縫合口近端運動纖維數量依次為235.41±32.70，229.74±61.53，202.72±55.09和199.61±28.78，縫合口遠端的運動纖維數量分別為7.35±4.39，10.95±3.18

21、，19.57±7.02和40.60±9.17，放大率依次為0.031±0.0184，0.045±0.0287，0.091±0.0221和0.195±0.049;建模后8、12、16和20周，縫合口近端運動纖維數量依次為254.10±47.75，218.06±27.80，231.44±30.40和230.51±40.06，縫合口的遠端運動纖維數量依次為180.57±41.50，290.82±49.52，289.53±44.47和277.4

22、9±46.59，放大率依次為0.774±0.216，1.26±0.35，1.36±0.27和1.209±0.411。(6)20周時肌皮神經纖維直徑為5.76±1.21μm，軸突直徑為4.01±1.08μm，髓鞘厚度為0.72±0.24μm，G比率為0.73±0.12;尺神經纖維直徑為4.28±0.84μm，軸突直徑為3.14±0.11μm，髓鞘厚度為0.53±0.19μm，G比率為0.62±0.09。(7)正常尺、肌皮神經神經的CMAP

23、的潛伏期分別為1.50±0.22 ms和1.24±0.27 ms。模型建立后的1-2周，未檢測到尺、肌皮神經CMAP。正常尺神經的波幅為6.77±1.62 mV;第3周開始，CMAP波峰逐漸增加。術后20周，波峰為4.14 mV，小于正常對照組(P＜0.05)。正常對照肌皮神經的波幅為9.46±2.33 mV。3周時，波峰為1.32mV;第3周開始，CMAP波峰逐漸增加，至術后20周，波峰為7.97mV，與正常組相比有明顯統(tǒng)計學差異(P

24、＜0.05)。20周時，尺神經CMAP波幅恢復率低于肌皮神經(P＜0.05)。
　　結論: 神經纖維代償性放大模型建立后20周時，(1)尺神經運動神經纖維放大率與肌皮神經相似，兩者無統(tǒng)計學差異P＞0.05;(2)尺神經感覺纖維放大率小于肌皮神經。(3)20周時尺神經的神經纖維直徑、軸突直徑和髓鞘厚度均小于肌皮神經(P＜0.05)。(4)20周時尺神經CMAP波幅、潛伏期恢復率低于肌皮神經（P＜0.05）。
　　第三部分尺、肌

25、皮神經再生代償性放大過程中遠端神經的神經營養(yǎng)因子表達與感覺纖維放大率的關系
　　目的: 分析神經纖維放大模型中，尺、肌皮神經縫合口遠端BDNF、GDNF、CNTF和NGF的mRNA的動態(tài)表達與感覺纖維放大率的關系。
　　方法: 224只成年健康清潔級雌性SD大鼠，體重150～200克。分成16組，每組8只。U-1、2、3、4、8、12、16、20分別代表尺神經放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周;M-1、2、

26、3、4、8、12、16、20分別代表肌皮神經放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以對側肢體相應神經作為正常對照。各組設立6只大鼠，切斷相應神經，作為神經切斷對照組。在術后的各時間點，分別取縫合口遠端尺、肌皮神經，行Real-time PCR檢測BDNF、GDNF、CNTF和NGF四種神經營養(yǎng)因子的mRNA拷貝量，并比較其在尺、肌皮神經中的差異。
　　結果: (1)每組標本中，mRNA含量均在0.1μg/mg以上。

27、其中U-1、U-2、U-3、U-4，以及M-1、M-2、M-3、M-4的總mRNA含量波動在0.38～0.46μg/mg，多于正常對照組的mRNA含量(P＜0.0001)。術后8周及更長時間組，各組總mRNA含量與正常組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。(2)尺神經纖維代償性放大模型組:①NGF mRNA:術后1、3、4周，神經放大組、神經切斷組表達量均高于正常對照組，而前兩者之間無差異。4周以后的其余時間點，各組之間無明顯統(tǒng)計學差異。各個

28、組mRNA拷貝量均隨著手術后時間的推移而逐漸下降。②BDNFmRNA:在正常對照組，未檢測到BDNF mRNA;在神經放大組，隨著時間推移，其拷貝量上升，3周時達到頂峰，之后逐漸下降，4周以后急劇下降，20周時檢測到低度表達。神經切斷組改變類似于神經放大組，但是處在一個更高的表達水平，在12周時較8周時輕微上升。③CNTF mRNA:在正常對照組各時間段均高度表達。神經放大組在術后1周即出現明顯下降，以后其拷貝量逐漸上升，在術后的20周

29、達到頂峰，但低于正常對照組水平。神經切斷組在術后1周，其值亦明顯下降，表達量穩(wěn)定。4周以后，神經放大組CNTF mRNA的拷貝量多于神經切斷組(P＜0.05)。④GDNF mRNA:在正常對照組，基本未檢測到GDNFmRNA表達。在神經切斷組，其拷貝量1到3周表達穩(wěn)定，4周之后急劇下降。神經放大組1到3周內表達亦較穩(wěn)定，但表達水平低于神經切斷組;8周開始明顯下降，20周時僅有極少量表達。4周后各時間點兩者之間無明顯差別。(3)肌皮神經纖

30、維代償性放大模型組:①NGF mRNA:術后1、3周，神經放大組表達量大于正常對照組;術后1、2、3周，神經切斷組表達量大于正常對照組(P＜0.05);術后的2、3周神經放大組表達量大于神經切斷組(P＜0.05)。4周以后的其余時間點，各組之間無明顯統(tǒng)計學差異。各個組NGF mRNA拷貝量均隨著手術后時間的移而逐漸下降。②CNTF mRNA:在正常對照組各時間段均高度表達。神經放大組在術后1周即出現明顯下降，下降比例在70％以上，之后隨

31、著時間的延長，其拷貝量呈現逐漸上升趨勢，在術后20周達到頂峰，但依然低于正常對照組水平。神經切斷組在術后1周，其值亦明顯下降，隨著失神經支配時間延長，未出現逐漸下降趨勢。4周以后，神經放大組CNTFm RNA的拷貝量多于神經切斷組（P＜0.05）。③BDNF mRNA:在正常對照組，未檢測到BDNF的mRNA;在神經放大組，其拷貝量逐漸上升，3周時達到頂峰，之后逐漸下降，8周以后僅少量表達，20周時已經無法檢測。神經切斷組改變類似于神經

32、放大組，但是處在一個更高的表達水平。④GDNF mRNA:在正常對照組，未檢測到GDNF mRNA表達。在神經放大組，其拷貝量從1周上升，之后下降;從8周開始急劇下降。1至12周內，神經切斷組的表達量均高于神經放大組，16周后兩者之間無明顯差別。(4)尺、肌皮神經模型組之間比較:①BDNFmRNA在各時間點遠端尺神經的表達量較肌皮神經低(P＜0.05);②GDNFmRNA在各時間點，遠端尺、肌皮神經的表達量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);

33、③NGFmRNA在建模后表達量均增加，3周后平緩下降。建模后的1到3周，其表達量在兩神經之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);4、8和12周時，遠端尺神經NGF mRNA表達量低于肌皮神經(P＜0.05);④3周以后的各時間點，遠端尺神經的CNTFmRNA表達量均較肌皮神經低(P＜0.05)。
　　結論: 尺、肌皮神經纖維代償性放大模型建立后，縫合口遠端的尺神經早期較低的BDNF mRNA、中晚期較低的NGF mRNA表達量是引起尺神