油酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導人近端小管上皮細胞凋亡和轉分化的實驗研究.pdf

1、目的:脂質(zhì)在腎臟細胞內(nèi)沉積，是許多腎臟疾病的常見病理變化，脂質(zhì)沉積造成細胞功能受損即所謂的“脂毒性(lipotoxicity)”。在蛋白尿(proteinuria)腎病中，脂毒性在腎小管間質(zhì)損傷過程中發(fā)揮重要作用，且與腎病預后相關。游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs），在血液中與白蛋白結合，通過腎小球濾過膜被近端小管重吸收，F(xiàn)FAs是蛋白尿性腎病小管損傷的一種重要介質(zhì)。肝型脂肪酸結合蛋白(liver-type fat

2、ty acid binding protein，L-FABP/FABP1)是脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP)家族的成員之一，主要在人肝臟、小腸、腎臟及胰腺組織中表達，參與胞內(nèi)脂肪酸的攝取、轉運和代謝調(diào)節(jié)。在慢性腎臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，尿中L-FABP水平與腎小管間質(zhì)損傷的嚴重程度密切相關，已證實當大量蛋白尿時，是FFAs而不是白蛋白引起腎小管損傷。但FFAs對腎小管損傷的具體機制尚不清楚。<

3、br>　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成、折疊和轉運的重要細胞器，是細胞應對各種應激進行信息整合的中心。ER為了適應正在改變的環(huán)境而形成了一個未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的信號途徑，通過增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的降解功能使蛋白質(zhì)生物合成減少，來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強細胞適應性，及時有效的逆轉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum

4、stress，ERS)，但持續(xù)或過強的UPR將最終導致細胞凋亡。FFAs可通過ERS引起胰島β細胞和肝細胞凋亡;大量蛋白尿時白蛋白可引起腎小管上皮細胞ERS。但有關FFAs是否通過ERS導致腎臟固有細胞凋亡的研究尚不多見。
　　 L-FABP作為FFAs的一個轉運體，并與其進行可逆性結合完成跨膜轉運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器。我們推測過多的FFAs轉運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起ERS及小管細胞凋亡和轉分化。本文將試圖通過對培養(yǎng)的人近端小管細胞系

5、（HK-2cells）的研究，用人體血液含量最高的FFAs—油酸(oleicacids，OA)，一種18碳單不飽和脂肪酸作為FFAs的代表，探討FFAs對腎小管損傷的機制。
　　 方法:人近端小管上皮細胞(HK-2)購自中國科學院上海細胞所。用含有10％胎牛血清，2mmol/1-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用5％C02，37℃的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待HK-2達80％～90

6、％融合后，用無血清培養(yǎng)基同步細胞24h。細胞分組如下:正常對照組，油酸組和無游離脂肪酸白蛋白組（以下簡稱為白蛋白組）。
　　 1、MTT法檢測不同濃度、不同時間點油酸和白蛋白的生長曲線，確定HK-250％生存率時的濃度及時間點;
　　 2、細胞常規(guī)爬片，掃描電鏡觀察干預12h時HK-2細胞超微形態(tài)改變;收集干預12hHK-2細胞，透射電鏡觀察細胞超微結構改變;
　　 3、細胞常規(guī)爬片，原位末端轉移酶標記技術(te

7、rminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測干預12h時HK-2細胞凋亡率;
　　 4、提取6h、12h、24h不同干預條件下HK-2細胞蛋白，Western Blot檢測L-FABP、GRP78、GADD153/CHOP、α-SMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Cas

8、pase-3的蛋白表達情況。
　　 結果:
　　 1、干預12h，HK-2細胞的50％生存率的油酸濃度是100μmol/l，而無游離脂肪酸的白蛋白濃度是10mg/ml。
　　 2、不同干預條件下12h時HK-2細胞超微結構改變
　　 (1)掃描電鏡觀察，正常對照組HK-2細胞間連接緊密，細胞膜菲薄細胞核位于中央，核仁明顯，細胞器圍繞細胞核周圍;與正常對照組相比無游離脂肪酸白蛋白組細胞皺縮，但細胞膜完好，細

9、胞外形呈荷葉狀或輪輻狀;而油酸組細胞體積縮小胞膜皺縮，細胞連接松散，細胞膜有破損，成篩孔狀，出現(xiàn)核裂孔，胞質(zhì)內(nèi)容物明顯增多，有的細胞器裸露。
　　 (2)透射電鏡觀察，正常對照組HK-2細胞發(fā)育良好，與正常對照組相比無游離脂肪酸白蛋白組細胞細胞器豐富;油酸組細胞膜破壞崩解，細胞微絨毛脫落，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞漿中可見脂滴和糖原顆粒，并有散在的微絲存在。染色質(zhì)濃染、邊集化，細胞核呈銳角突起出現(xiàn)了凋亡的早期表現(xiàn)。
　　 3

10、、不同時間點油酸干預下HK-2細胞L-FABP蛋白的表達
　　 油酸干預HK-2細胞1h、3h、6h、12h和24h后，細胞總蛋白WesternBlot結果顯示:6h開始表達上調(diào)，12h達到峰值，24h表達有所減低。
　　 4、不同干預條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達
　　 細胞總蛋白WesternBlot結果顯示:細胞干預6h、12h和24h，三個時間點高油酸組和高白蛋白組GRP78和GADD/CHOP表達均高于

11、正常對照組;而高油酸組表達又高于高白蛋白組。
　　 5油酸對HK-2細胞凋亡的影響
　　 (1)TUNEL檢測表明12h時油酸組凋亡細胞率顯著高于正常對照組和白蛋白組，正常對照組與白蛋白組間沒有差別;
　　 (2)Western Blot結果:干預6h、12h和24h的HK-2細胞，油酸組Caspase-3和CleavedCaspase-3比正常對照組和白蛋白組表達增加，且油酸組Bax/Bcl-2比率較其他兩組高

12、，正常對照組與白蛋白組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 6、油酸對HK-2細胞轉分化的影響
　　 干預12h的HK-2細胞，油酸組α-SMA表達較正常對照組和白蛋白組表達增加，而正常對照組與白蛋白組間無差別。
　　 結論:
　　 1、油酸可以上調(diào)HK-2細胞L-FABP蛋白和ERS相關蛋白GRP78、GADD/CHOP的表達，L-FABP的上調(diào)先于ERS相關蛋白的上調(diào)。我們推測油酸通過L-FABP誘發(fā)ERS，

13、并激活ERS相關的凋亡通路。
　　 2、油酸還可以上調(diào)Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白，使Bax/Bcl-2比值增加。熒光TUNEL染色證實OA干預引起細胞凋亡。這兩部分結果說明油酸引起的細胞凋亡至少部分是通過ERS途徑來完成的。
　　 3、HK-2細胞在油酸干預下無論在形態(tài)還是功能上均表現(xiàn)出肌纖維母細胞的特性，說明OA干預導致HK-2細胞發(fā)生轉分化。
　　 綜合上述，本實驗證實油酸既可