朱砂葉螨適應取食棉花相關基因篩選及應用.pdf

1、植食性昆蟲、葉螨與自然界植物在長期的進化過程中，逐漸形成寄主單食性和寄主多食性兩種。朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）作為一種重要的多食性農業(yè)害螨，能夠取食危害多種寄主植物。朱砂葉螨通過消化將從不同寄主植物獲取的食物代謝成營養(yǎng)物質，為自身的生長發(fā)育提供物質基礎，同時利用自身進化的解毒代謝系統(tǒng)，將接觸到的外源有毒物質轉化代謝為無毒物，這被認為是朱砂葉螨能夠適應取食多種寄主植物的兩條關鍵代謝通路。
　　本文利

2、用高通量測序技術比較朱砂葉螨分別取食豇豆和棉花后數字基因表達譜，獲得大量朱砂葉螨適應取食棉花的差異表達基因，明確了消化代謝和解毒代謝兩大通路中差異表達的相關基因;并從兩大通路中篩選出朱砂葉螨適應取食棉花的重要相關基因，克隆獲得相關基因的開放閱讀框序列并驗證其表達水平。在此基礎上，利用植物介導的RNAi技術將朱砂葉螨兩條P450基因的部分互補DNA序列導入到棉花植株使其表達獲得轉基因棉;通過qPCR技術檢測朱砂葉螨取食轉基因棉后體內對應靶

3、基因的表達水平;運用種群生命表技術比較、分析朱砂葉螨取食轉基因棉后適合度代價變化，初步明確轉基因棉的抗螨效果。獲得的主要研究結果如下:
　　1.采用高通量測序技術比較朱砂葉螨轉移取食棉花后(8h、50d)數字基因表達譜，結果顯示朱砂葉螨從豇豆轉移取食棉花后，有近500條基因差異表達，其中取食棉花8h后有174條基因差異表達（上調97，下調77），取食50d后有433條基因差異表達（上調384，下調49）。將差異基因比對到Nr、二斑

4、葉螨基因組、COG、KEGG和GO等數據庫，最終272條基因獲得功能注釋，其中與解毒代謝相關基因24條，與消化代謝相關基因17條。
　　2.根據表達譜獲得的差異表達基因，從中篩選出4條朱砂葉螨適應取食棉花的重要相關基因。這4條基因表達差異倍數均高于4倍，表達豐度均超過18，功能分別注釋為:細胞色素P450單加氧酶（tcCYP1和tcCYP2），羧酸酯酶(tcCCE)和絲氨酸蛋白酶(tcSP)。分別克隆獲得tcCYP1基因開放閱讀框

5、1482 bp，GenBank登錄號為KR002098; tcCYP2基因開放閱讀框1512 bp，GenBank登錄號為KR002099; tcSP基因開放閱讀框891 bp，GenBank登錄號為KR002101;獲得tcCCE基因下游片段1417 bp，GenBank登錄號為KR002100。qPCR檢測結果顯示，4條基因表達趨勢與表達譜測序結果基本一致。
　　3.利用農桿菌介導法將兩條P450基因的互補DNA序列導入棉花植

6、株培育轉基因棉，最終成功獲得四株（P2，P4，P5和P6）轉基因棉。qPCR技術檢測目的基因表達水平結果顯示，朱砂葉螨分別取食四株轉基因棉24h后，兩條P450基因在螨體內的表達水平均無顯著差異;在P4植株生存一代后，螨體內tcCYP1基因的表達水平顯著下調;在P2植株生存一代后，螨體內tcCYP2基因的表達水平顯著下調，取食其余植株后均未檢測到靶基因的下調變化。
　　4.運用種群生命表技術比較朱砂葉螨取食轉基因棉和常規(guī)棉后各發(fā)育