東方蜜蜂抗螨相關基因的篩選及初步驗證.pdf

1、狄斯瓦螨(Varroa destructor)是對蜜蜂威脅最大的病蟲害，幾乎對全世界范圍內的養(yǎng)蜂業(yè)都造成了巨大的損失。本研究基于課題組前期研究所獲得的寶貴的蜂螨敏感型群體，采用Illumina Solexa測序技術及iTRAQ技術初步篩選出蜂螨抗性相關的候選基因，通過熒光定量PCR技術驗證候選差異基因，并對相關基因編碼區(qū)序列測定分析。本研究為進一步研究蜜蜂抗螨分子機理奠定基礎，同時篩選出來的差異基因可為蜜蜂抗螨育種研究提供基因資源。主要

2、研究結果如下:
　　1.本研究選擇狄斯瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾對抗性群體及敏感性東方蜜蜂群體進行脅迫，采用以下措施降低各群體間的遺傳背景:a）受蜂螨脅迫的抗性群體(C+)和受脅迫的敏感性群體(M+)所接受的西方蜜蜂巢脾受狄斯瓦螨蜂螨感染程度相當且具有數量相當的工蜂和雄蜂的封蓋蜂房;抗性對照組(C)及敏感性對照組(M)使用未受瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾。b）采用10對微衛(wèi)星引物選擇全同胞姐妹用于下一步實驗。c）對蜂群受瓦螨脅迫的情況進行連

3、續(xù)觀察，發(fā)現敏感性群體抗螨能力較差，而抗性群體則在遭到蜂螨脅迫后24h時抗螨行為達到高峰，因此確定脅迫24h后進行樣本采集。
　　2.采用Illumina Solexa轉錄組測序技術對蜂螨脅迫及未遭蜂螨脅迫的敏感性和抗性東方蜜蜂群體進行哺育蜂頭部轉錄組測序，從頭組裝獲得了91，172個unigenes，對這些unigenes進行功能注釋。COG分類中，共有23，790條unigene歸類到25類基因功能。GO分類注釋了85，577

4、條unigene的生物學途徑，其中參與細胞生理過程(14，797)和代謝過程(10，17)的最多;注釋了48，194條unigene的細胞學組件，其中細胞及細胞組分最多，都為10，323條;描述了29，301條unigene的分子功能，其中結合功能(11，370)和催化活性(11，042)的最多。39，625條在KEGG數據庫中注釋到257條通路，定位到代謝通路的unigene數量最多(4793)。
　　3.C+VS M+共產生了

5、40，255條差異unigene，其中19，702條在C+下調表達，20,553條在C+上調表達。GO顯著富集分析表明蜂螨抗性及敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時體內發(fā)生了不同的應答反應，而這些應答反應很可能伴隨轉錄因子的變化。多條顯著富集的pathway涉及病菌感染及抗菌物質的生物合成，說明敏感性蜂群和抗性蜂群對病菌的抵抗力存在差異。
　　CVSM共有21，252條差異unigene，其中962條在C下調表達，20,290條在C上調

6、表達。GO顯著富集分析說明東方蜜蜂蜂螨抗性群體和敏感群體間存在免疫反應、肌肉發(fā)育、學習和記憶方面的差異。有71個DEGs被富集到了嗅覺轉導通路中，說明可能兩個群體間的嗅覺系統存在差異。
　　C+VS C共有36，691條差異unigene，其中17，799條在C+下調表達，18，892條在C+上調表達。GO顯著富集分析表明在蜂螨脅迫的情況下，東方蜜蜂產生了一定的應答反應，伴隨的可能為轉錄因子的表達差異。多條顯著富集的pathway

7、涉及病菌感染及抗菌物質的生物合成，說明抗性群體在受到蜂螨脅迫時也同時受到了細菌的感染，同時通過自身免疫積極抵抗細菌。
　　M+VSM共有24，508條差異unigene，其中21，479條在M+下調表達，3029條在M+上調表達。GO顯著富集分析說明蜂螨敏感性蜂群在受到蜂螨脅迫時，其嗅覺功能發(fā)生了變化，可能形成了短期記憶，并伴隨轉錄因子的表達差異。多條顯著富集的pathway涉及細菌及病毒感染，只有O聚糖生物合成(0.49％)與免

8、疫相關，說明敏感性群體對于細菌病毒的抵抗力低于抗性群體。
　　4.Venn分析關注到的差異基因中，在C+中呈現極高表達的DEGss（Log2 Ratio≥15）上調的270個，下調的8個，結合所有差異基因的GO及pathway顯著富集分析結果進行進一步的分析，發(fā)現以下基因與抗螨相關:氣味結合蛋白、肌鈣蛋白、鈣離子運輸ATPase、轉錄因子、免疫相關基因、表皮蛋白、突觸蛋白。
　　5.以東方蜜蜂轉錄組數據作為參考序列，對四樣本

9、哺育蜂頭部蛋白質進行iTRAQ定量分析，共鑒定到1532個蛋白質。GO分析顯示與細胞組分相關的表達蛋白最多的是細胞和細胞組分相關蛋白，共占61.02％。結合功能包含的蛋白數量最多(45.30％)。大部分蛋白參與到基本的生物學過程，如細胞進程(20.01％)及代謝進程(19.68％)。pathway分析發(fā)現共有1503條蛋白注釋到239個通路中，注釋到新陳代謝通路的蛋白最多，這與轉錄組數據一致。
　　6.C+VSM+共產生了72個差

10、異蛋白，其中31個在C+下調表達，41個在C+上調表達。GO顯著富集分析說明蜂螨抗性及敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時體內發(fā)生了不同的應答反應，這與轉錄組數據也是相符合的。差異蛋白顯著富集的pathway為鞘脂類代謝。
　　CVSM共有154個差異蛋白，其中82個在C下調表達，72個在C上調表達。GO顯著富集分析說明蜂螨抗性東方蜜蜂和蜂螨敏感性東方蜜蜂的生命活力存在差異。差異蛋白顯著富集于17個pathway，最為顯著的是代謝途徑。

11、
　　C+VS C共有202個差異蛋白，其中81個在C+下調表達，121個在C+上調表達。GO顯著富集分析說明東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時體內發(fā)生了一系列的代謝產能反應及應答反應。差異蛋白顯著富集于14個pathway，最為顯著的為震顫性麻痹病。
　　M+VSM共有161條差異unigene，其中94個在M+下調表達，67個在M+上調表達。GO顯著富集分析說明蜂螨敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時，其生命活動受到了影響，并且體內發(fā)生

12、了一定的應答反應。差異表達蛋白顯著富集于25個pathway，最為顯著的為震顫性麻痹病。
　　7.韋恩分析及與轉錄組關聯分析顯示endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2-like及obp13與抗螨相關。
　　8.將基于參考基因得到的蛋白質鑒定結果和轉錄組結果進行關聯，CVSM組中關聯性(r)為0.3269; rM+VSM為0.0066; C+VS M+為0.0737; C+VS

13、C為0.0774。結果表明兩者間相關性較低。
　　9.對嗅覺通路中的3個差異基因及其它與抗螨性狀相關的差異基因共15個DEGss進行了qRT-PCR驗證，結果顯示其表達規(guī)律與轉錄組數據一致，說明轉錄組測序結果是可靠的。對obp17，obp18及mklb-1編碼區(qū)進行了克隆測序，獲得的obp17,obp18及mklb-1編碼區(qū)序列長度分別為408bp，399bp，4887bp。將東方蜜蜂obp4，obp17, obp18及mklb-