網織血小板檢測方法的改進及其在血液疾病診斷中的應用.pdf

1、研究背景： 1969年Ingram和Cooper smith在對失血性Beagle犬的外周血經新亞甲藍染色的鏡檢中，觀察到部分清晰的濃染網狀結構的血小板，被命名為網織血小板(Reticulated platelet，簡稱RP)<'[1]>。網織血小板是由骨髓巨核細胞新近釋放入外周血的血小板<'[2]>，不含核或DNA成分，卻含有少量的mRNA和粗面內質網，保留了合成少量蛋白質的能力，它反映了循環(huán)中最年輕的血小板<'[3]>。近年

2、來，隨著網織血小板檢測方法的不斷改進，流式細胞儀和網織細胞檢測儀在臨床上的廣泛應用，使其在機體造血功能中的臨床意義的得以深入研究，成為分析血小板的生成狀態(tài)的有用指標<'[1]>。但是由于目前國內外網織血小板檢測的方法還未統(tǒng)一，檢測過程復雜，參考值也有較大的差異，臨床應用受到了一定的限制。 目的： 在上述研究背景下，我們通過實驗設計來探討以下幾個問題： 1．應用流式細胞技術檢測網織血小板的方法。在現有流式細胞技術基

3、礎上，比較全血和血漿標本檢測網織血小板的差異，并對檢測方法進行改進，確定噻唑橙檢測網織血小板的最佳條件，簡化檢測方法。 2．確定流式細胞技術檢測網織血小板的正常人群的參考值，比較男性和女性參考值差異性。 3．對網織血小板與血小板相關參數(平均血小板體積MPV、血小板分布寬PDW、大血小板比例P-LCR)結果之間的關系進行探討。 4．初步探討網織血小板在血小板減少性疾病鑒別診斷中的臨床意義，通過網織血小板的檢測，區(qū)

4、分不同病因引起的血小板減少性疾病，從而進行病因分析。 方法： 1．探討流式細胞儀檢測網織血小板的方法； 探討流式細胞儀檢測RP的方法，并對網織血小板的檢測方法進行改進，通過析因設計的方差分析確定噻唑橙檢測網織血小板的最適合的檢測條件，用CD42b-PE單抗標記血漿及全血中的血小板，再用熒光染料噻唑橙(thiaZolorange，TO)染色網織血小板內RNA。以流式細胞儀對RP百分率進行檢測。 分別對全血及

5、血漿樣本在不同TO濃度及孵育時間下的網織血小板進行測定，確定網織血小板測定的最佳TO濃度及孵育時間。 在一定檢測條件下，比較全血和血漿檢測網織血小板的差異。對一樣本進行10次連續(xù)性測定，檢測其CV值，驗證該方法的重復性。 2．確定網織血小板的正常參考值； 以100例健康人做為正常對照組(其中男性50例，女性50例)，對正常對照組的RP百分率及RP絕對值進行檢測。并對結果進行統(tǒng)計學分析，從而對男性和女性的結果差異進

6、行比較。 3．對RP百分比與血小板相關參數(MPV、PDWP-LCR)的結果之間的關系進行分析： 通過對147例樣本的網織血小板與MPV、PDW、P-LCR的檢測結果進行相關分析，比較他們的相關性。并將MPV>11.0f1組的RP％與正 MPV(11.0f1組進行比較，比較兩者的差異性。 4．初步探討網織血小板對血小板減少性疾病的鑒別診斷的臨床意義； 對不同原因造成的血小板減少的病人進行網織血小板測定，繼

7、而對血小板減少的原因進行分析，從中找出網織血小板對血小板減少性疾病的鑒別診斷價值。入選病例為特發(fā)性血小板減少性紫瘢(idiopa，thic thrombocytoperlicpurptlra，ITP)12例、再生障礙性貧血(aplastic arlemia，AA)12例、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)36例、急性非淋巴細胞白血病(actlte non-lymphocytic leuke

8、mia，ANLL)30例、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syridrome，MDS)5例、慢性粒細胞白血病(chronicmyelocytic letJkemia，CML)8例。對這些病人的血小板總數及網織血小板百分比及絕對值進行測定，對男性與女性結果進行分組與正常對照組結果進行比較。對不同類型血液疾病的網織血小板結果進行分析，對網織血小板反映骨髓血小板生成狀況的情況進行評估。 結果： 1．我們通過

9、析因設計的方差分析，發(fā)現流式細胞儀測定RP的結果受到T0濃度及孵育時間的影響，隨著T0濃度的提高及孵育時間的延長RP的結果呈現明顯的上升趨勢。通過析因設計的方差分析表明在T01:2稀釋的條件下60min與90min時間段內RP％檢測結果差異較其它組小，因而選擇T01:2稀釋條件下孵育60min作為測定時條件，實驗條件相對較容易控制。在該條件下能夠較好的區(qū)分網織血小板，且結果穩(wěn)定；并且對比了18例血漿和全血的檢測結果，相關系數0.997，

10、二者顯著相關，并對二者結果進行成對樣本的t檢驗，P>0.05，二者無顯著性差異，該方法重復性CV％為1.32％，重復性好，因而適合于臨床檢測網織血小板。 2．檢測了100例健康人RP％，結果為： 9.72％±2.59％(x±SD)，其中男性50例，RP％為9.15％±2.01％，女性50例，RP％為10.29％±2.97％。女性的結果高于男性，P<0.05，男女間差異具有統(tǒng)計學意義。用血小板總數乘以網織血小板百分比可得于網織血小

11、板絕對值，100例正常人的網織血小板絕對值(RP)為：21.29±6.75(×10<'9>/L)，其中男性50例，RP為19.46±5.52(×10<'9>/L)，女性50例，RP為23.13±7.39(×10<'3>/L)。女性的結果高于男性，P<0.05，男女間差異具有統(tǒng)計學意義。 3．通過對147例標本(男性組72例、女性組75例)同時檢測RP％及MPV、PDW、P-LCR，RP％與MPV的檢測結果進行相關分析，男性組：Y

12、=0.407，P<0.001，女性組：Y=0.452，P<0.001，RP％與MPV之間呈正相關關系。在MPV≥11.0f1組的RP％為13.63％±6.15％，MPV<11.0f1組的RP％為9.80％±4.56％，P=0.001，二者具有顯著性差異。RP96與PDW及P-LCR也均呈現相關關系。 4．12例ITP病人RP％測量結果為28.87％±8.91％(范圍從15.16％-44.9896)，明顯高于正常對照組，4例治療后

13、的ITP病人RP％為9.06％±3.8796，與正常對照組無差異；12例AA的RP％為5.96％±3.01％(范圍從2.50％-14.49％)，低于正常對照組，RP絕對值為1.57±1.90(×10<'9>/L)，結果明顯低于正常對照組。36例ALL組RP％為12.20％±5.33％，30例ANLL組RP％為10.83％±5.16％，與正常對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；8例慢性粒細胞白血病RP絕對值為：139.67±80.0

14、6(×10<'9>L)，RP絕對值明顯高于正常對照組(P=0.000)。5例MDS病人RP％為21.75％±7.37％，高于正常對照組(P<0.05)。 5．RP％與骨髓巨核細胞相關性分析：分析了6例病人骨髓巨核細胞檢測結果，并與RP％結果進行了對照分析，發(fā)現6例病人的網織血小板的檢查結果與骨髓巨核細胞檢查結果相符。 結論： 1．應用流式細胞技術檢測外周血網織血小板的最佳T0濃度為1:2稀釋、染色時間為60分鐘，

15、此時能夠較好的區(qū)分網織血小板，且實驗條件容易控制，適合于臨床檢測。 2．在以上條件下，使用全血和富血小板血漿檢測結果接近，二者均適合于流式細胞技術常規(guī)檢測網織血小板。使用全血作為檢測物可以簡化實驗步驟，減少操作過程對檢測結果的干擾。 3．正常對照組男性網織血小板值低于女性，二者間數值差異具有統(tǒng)計學意義。 4．MPV、PDW和P-LCR與RP％有一定的相關關系，MPV高于11.0f1組RP％高于MPV小于11.0f

16、1組，提示血小板體積增大的病人RP％增高。 5．RP％在不同血液疾病中的測定結果顯示RP％對于血小板減少性疾病的病因診斷有一定參考價值，ITP病人RP96顯著增高，而AA病人RP絕對值減低，CML病人RP絕對值顯著增加，其結果與骨髓巨核細胞的數量具有一定的相關性，通過RP96的檢測，可以間接的判斷骨髓巨核細胞的生成狀況，從而對血小板減少的原因進行分析。 本研究的主要創(chuàng)新點： 1．在國內首先采用CD42b-PE單抗

17、與T0雙標記檢測全血中網織血小板，改進了流式細胞技術檢測網織血小板的方法。探討了全血標本檢測網織血小板的條件，簡化了檢測步驟。 2．建立正常人群全血標本網織血小板的參考值。 3．通過對RP％與P-LCR進行比較，找出了兩者之間的相關性。 4．首次在國內報道了RP％直接與骨髓巨核細胞數量的研究結果，為骨髓造血功能的測定提供了一個較簡便的臨床應用指標。 5．觀察了RP和RP％在ITP病人組、從病人組和CML病