廣西巴馬小型豬Myostatin和Leptin基因的克隆、表達及動物免疫實驗.pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin)屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一，又名為生長／分化因子-8(GDF-8)。Myostatin是在骨骼肌中廣泛表達的一類糖蛋白，其作用特征是對肌肉生長有負調控作用，myostatin基因自然突變導致其生物活性的改變可以引起肌肉重量的顯著增加。 瘦素蛋白(Leptin)是由脂肪組織合成的一種重要肽類激素。通過與細胞膜上的長型受體結合，leptin啟動了胞內一系列的信號轉導系統(tǒng)，將身

2、體能量貯存水平信號傳送至大腦，從而對能量攝入與消耗進行調節(jié)。 參照GenBank發(fā)表的豬myostatin和leptin基因序列，分別設計兩對特異性引物，以廣西巴馬小型豬肌肉組織和脂肪組織的總RNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出相應的cDNA片段。擴增片段純化后，連接到pMD18-T載體，轉入DH5α細菌擴增并測序。結果表明：擴增的myostatin基因序列為1128bp，leptin成熟肽基因序列為441

3、bp，包含了各自成熟肽序列。同源性比較顯示，廣西巴馬小型豬myostatin和leptin基因與GenBank報道的豬的相應基因序列的同源性分別達到99.7％和99.1％。 將克隆得到的myostatin和leptin基因序列，分別加入BamHI和EcoRI、BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，定向連接到原核表達載體pRSETA質粒上，構建pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin融合表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE

4、3)LysS。經SDS-PAGE和western Blotting分析，本研究成功地表達了myostatin和leptin的融合蛋白。表達蛋白經1 mmol/L IPTG誘導7h(myostatin)或4h(leptin)表達量達到最高，并以包涵體的形式存在。將pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin重組菌進行大量表達后，包涵體用6mol/L的鹽酸胍變性，可溶部分在50％Ni-NTA樹脂上過柱純化，通過透析使蛋白質復性，得

5、到較純的MSNT75和leptin融合蛋白。利用純化得到的融合蛋白制備了MSNT75和leptin融合蛋白油乳劑疫苗。 本研究應用廣西巴馬小型豬myostatin成熟肽重組融合蛋白疫苗主動免疫小鼠、廣西巴馬小型豬和雞后，實驗組和對照組相比，其平均體重和平均增重都有下降的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，體內并未檢測到相應的抗體。用廣西巴馬小型豬leptin成熟肽重組融合蛋白疫苗主動免疫小鼠后，小鼠的體重沒有顯著變化(P>0.0