無花果內生真菌分離鑒定及其活性研究

1、<p>　　無花果內生真菌分離鑒定及其活性研究</p><p>　　馬養(yǎng)民1，徐小娜1, 張弘弛1，2</p><p>　?。?. 陜西科技大學教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室，西安 710021;</p><p>　　2. 山西大同大學農學與生命科學學院，山西大同 037009）</p><p>　　摘 要：[目的]分離和鑒

2、定無花果(Ficus carica)植物內生真菌，并比對其進行活性篩選。[方法]采用形態(tài)學方法對分離菌株進行鑒定，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白菜黑斑病菌、蘋果腐爛病菌、小麥赤霉病菌、草莓枯萎病菌、青霉菌為測試菌對分離得到的植物內生真菌進行抗菌活性實驗。[結果]從健康的無花果植物的根、莖、葉中分離共獲得61株內生真菌。屬于5綱，7目，12科，20屬?？咕钚栽囼灡砻饔?0株內生真菌具有抗菌活性,占總內生真菌的65.57%。 [結論]無花

3、果植物內生真菌多樣性豐富，具有很好的研究和應用價值。</p><p>　　關鍵詞：無花果；內生真菌；分離；鑒定；抗菌活性</p><p>　　Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Ficus carica and Their Antimicrobial Activity</p><p>　　MA

4、Yang-min, XU Xiao-na, ZHANG Hong-chi</p><p>　?。?. Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education. Shaanxi University of Science & Technology, Xi'a

5、n, 710021, China；</p><p>　　2. College of Agronomy and Life Science, Shanxi Datong University, Datong, Shanxi 037009, China)</p><p>　　Abstract: [Objective] The aim of this study was to isolate th

6、e endophyte of Ficus carica and screen of its antibiotic activities. [Method] The endophytic fungi were indentified by morphology, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Alternaria brassicae, Valsa mali, Fusarium Grami

7、nearum, Fusarium oxysporumf. sp .fragariae, Penicillium notatum were selected as the indicator to test the inhibitory activity of the isolated strains.[Result] Sixty-one strains of endophytic fungi were isolated from th&

8、lt;/p><p>　　Key words: Ficus carica; Endophytic fung; Isolation; Identification; Antimicrobial activity</p><p>　　無花果(Ficus carica)系?？茻o花果屬的多年生木本植物[1]，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學中一種重要的藥用植物，全株均可入藥，具有一定的抗高血壓作用，最引人矚目的是無花果含

9、有多種抗癌活性成分。國內外研究表明,無花果的果實有提高人體的免疫力、抑制4種癌細胞發(fā)生發(fā)展的神奇功效,具有抗癌作用,故有人稱其為“抗癌斗士”和“21世紀人類健康的守護神”[2]。目前，國內對于無花果內生真菌的研究報道較少[3-4]，為此，我們對無花果植物內生真菌作了系統(tǒng)的研究，包括菌株分離、種群組成、數(shù)量與分布及其抗菌活性等。本研究的目的在于通過重新對無花果植物內生真菌的分離與鑒定及其活性篩選，以便發(fā)現(xiàn)一些具有較高生物活性或新的菌株，為

10、無花果內生真菌的進一步的研究開發(fā)奠定基礎。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料</b></p><p>　　1.1.1 植物樣品</p><p>　　無花果，采自西北農林科技大學校園，無其他病蟲害。取材部位為根、莖和葉。</p>

11、<p><b>　　1.1.2 培養(yǎng)基</b></p><p>　　分離培養(yǎng)基（抗生素培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g；葡萄糖l0 g；瓊脂20 g，鏈霉素200 mg，水1000 mL。</p><p>　　純化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g；葡萄糖l0 g；瓊脂20 g；水1000 mL。 </p><p><b>

12、;　　1.1.3 測試菌</b></p><p>　　細菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）。</p><p>　　植物病原真菌：白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、小麥赤霉病菌（Fusarium Graminearum）、草莓枯萎病菌（Fusa

13、rium oxysporumf.sp.fragariae）青霉菌（Penicillium notatum）。</p><p>　　1.2 內生真菌的分離純化</p><p>　　于2009年11月初采樣，按照文獻[4]方法，以無花果的根、莖、葉為材料進行分離。其中與文獻[4]不同的是有效氯濃度為2%的次氯酸鈉，消毒時間為3 min。</p><p>　　1.3 內生

14、真菌的分類鑒定</p><p>　　采用形態(tài)學法，根據(jù)內生真菌主要的群體形態(tài)特點(包括菌落大小、顏色、表面特征、質地)和個體形態(tài)特點(包括菌絲、子實體和孢子形態(tài))，對其進行鑒定和分類[6-8]。</p><p>　　1.4 內生真菌的抗菌活性篩選</p><p>　　1.4.1 內生真菌的培養(yǎng)</p><p>　　將分離獲得的內生真菌分別接人

15、PDA固體培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)3天，用打孔器制成6 mm的菌餅備用。</p><p>　　1.4.2 指示菌的培養(yǎng)</p><p>　　將待試的2株細菌接入營養(yǎng)肉湯斜面，5株植物病原真菌接入PDA斜面，置于培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)。</p><p>　　1.4.3 抗菌實驗</p><p>　　用5 mL無菌水直接沖洗測試菌的斜面

16、，搖勻后，滴一滴于血球計數(shù)器載玻片小室內，蓋上蓋玻片（注意排除氣泡），顯微鏡下進行計數(shù)。然后稀釋到濃度為106個／mL的菌懸液。將1 mL菌懸液快速倒入30℃～37℃融化的9 mL培養(yǎng)基中，搖勻后迅速裝到培養(yǎng)皿中，冷卻后得到含有不同測試菌的培養(yǎng)基。將菌餅輕放其上，置于28℃培養(yǎng)24 h～36 h，測量抑菌圈大小。</p><p><b>　　2 結果與分析</b></p>&l

17、t;p>　　2.1 無花果內生真菌的種群組成及不同部位的分布</p><p>　　從無花果植物中分離獲得61株內生真菌，經形態(tài)學方法觀察，分屬于5綱，7目，12科，20屬(見表1)，</p><p>　　表 1 無花果內生真菌種群的組成</p><p>　　Table 1　The composing of endophytic fungi in Ficus c

18、arica</p><p>　　從表1可看出，在分離獲得的61株內生真菌中，鏈格孢屬(Alternaria sp.)最多，為13株，占21.31%；其次是鐮孢霉屬（Fusrium sp.），為8株，占13.11%；青霉屬(Penicillium sp.)，為6株，占9.84%；擬青霉屬(Penicilliopsis sp.)為5株，占8.20%。這4屬為無花果的內生真菌優(yōu)勢屬，占總數(shù)的52.46%。</p&

19、gt;<p>　　其中有11屬之前已鑒定出[4]，如葡萄孢屬、聚端孢霉屬、曲霉屬等。其余9屬是這次實驗新鑒定出的。</p><p>　　無花果植物內生真菌在不同的部位分布是不相同的（見表2）。</p><p>　　表 2 不同部位真菌菌株比較</p><p>　　Table 2 Comparison of the strains of fungi a

20、mong different position</p><p>　　從表1、2還可以看出不同的部位中內生真菌分布并不平均。從無花果莖中分離出21株內生真菌，占總菌株的34.43%，屬于16個屬，其中鏈格孢屬(Alternaria sp.)為優(yōu)勢屬，占總菌株的4.92%；根中分離出20株內生真菌，占總菌株的32.79%，鐮孢霉屬(Fusrium sp.)、青霉屬(Penicillium sp.)為優(yōu)勢屬，分別占總菌

21、株的8.20%、4.92%；葉中分離出20株內生真菌，占總菌株的32.79%，屬于10個屬，其中鏈格孢屬(Alternaria sp.)為優(yōu)勢屬，占總菌株的13.11%。青霉屬(Penicillium sp.)、鏈格孢屬(Alternaria sp.)、鐮孢霉屬(Fusrium sp.)、擬青霉屬(Penicilliopsis sp.)這四個屬在無花果的根、莖、葉三個部位都有分布。說明這四個屬在無花果中普遍存在。而瘤座霉屬(Tuberc

22、ularia sp.)只在根中發(fā)現(xiàn)。擬粉孢霉屬(Oidiopsis sp.)、棒孢霉屬(Clavispora sp.)僅在莖中分布，離蠕孢屬(Bipolaris sp.)、殼明單隔孢屬(Diplodina sp.</p><p>　　2.2 無花果內生真菌活菌抑菌活性篩選結果</p><p>　　從無花果中分離到的61株內生真菌,通過對7種測試菌進行抑菌試驗,發(fā)現(xiàn)有40株對一種以上的測試菌

23、有抑制作用，占總菌株的65.57%，其中22株內生真菌對5種以上的測試菌具有抑制作用，占總菌株的36.07%；32株內生真菌對3種以上的測試菌具有抑制作用，占總菌株的52.46%。也有菌株對所有測試菌均無抑制作用。結果見表3。</p><p>　　表 3 無花果內生真菌的抗菌活性</p><p>　　Table 3 Antimicrobial activity of the endophy

24、tic fungi from Ficus carica</p><p>　　注:① F表示無花果,R表示根部,L表示葉部,S表示莖部;</p><p>　?、?-:Φ<6 mm;+:6<Φ<10 mm;++:10 mm<Φ<16 mm;+++:16mm<Φ<26 mm;++++:Φ>26 mm；</p><p>　　③

25、 A表示大腸桿菌，B表示金黃色葡萄球菌，C表示草莓枯萎病菌，D表示白菜黑斑病菌，E表示小麥赤霉病菌，F(xiàn)表示蘋果腐爛病菌，G表示青霉菌。</p><p>　　Notes:① F—Ficus carica, R—Root, L—Leaf, S—Stem;</p><p>　?、?-:Φ<6 mm;+:6<Φ<10 mm;++:10 mm<Φ<16 mm;+++:1

26、6mm<Φ<26 mm;++++:Φ>26 mm。</p><p>　?、?A—Escherichia coli, B—Staphylococcus aureus, C—Fusarium oxysporumf.sp.fragariae, D—Alternaria brassicae, E—Fusarium Graminearum, F—Valsa mali, G—Penicillium nota

27、tum.</p><p>　　從表3可以看出，61株內生真菌對測試菌的抑制作用具有一定差異。從抑菌效果來看，對細菌的抑菌作用效果比較明顯，對金黃色葡萄球菌有抑制作用有32株，占總菌株的52.46%；對大腸桿菌有抑制作用有29株，占總菌株的47.54%，而在植物病原真菌中對草莓枯萎病菌的抑制作用效果最明顯，有33株，占總菌株的54.10%；對蘋果腐爛病菌的抑制作用最差，有2株，占總菌株的3.28%；對青霉菌有抑制作

28、用有31株，占總菌株的50.82%；對小麥赤霉病菌有抑制作用有30株，占總菌株的49.18%；對白菜黑斑病菌有抑制作用有9株，占總菌株的14.75%?；钚跃昕咕钚远嘁愿呋钚詾槎?抑菌圈直徑＞16 mm)，低活性和中等活性的菌株較少。說明無花果內生真菌中存在著廣泛的抗菌活性資源。</p><p>　　還可以看出，抗菌活性的真菌主要分布在莖和根中。莖中有18株具有抗菌活性,占抗菌活性菌株總數(shù)的45%；根中有14株

29、具有抗菌活性,占抗菌活性菌株總數(shù)的35%；葉中有8株具有抗菌活性,占抗菌活性菌株總數(shù)的20%。其中FL03、FL14、FS04、FS05、FS06、FS12、FS16這7株內生真菌對6種測試菌都有很明顯的抑菌性（抑菌圈直徑≥19 mm），而FL03屬于擬青霉屬，對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑可達到24.5 mm；FL14屬于擬青霉屬，對大腸桿菌和白菜黑斑病菌抑菌圈最大，抑菌直徑分別為38 mm、25 mm；FS16屬于擬粉孢霉屬，抑菌性也很

30、明顯，對6種測試菌的抑菌圈直徑在19 mm~25 mm范圍內。說明這些菌株有潛在的抗菌物質的存在，值得進一步研究和開發(fā)。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　內生真菌分離研究中分離培養(yǎng)條件和表面消毒是兩個主要的關鍵因素。分離培養(yǎng)條件掌握不當，會使植物內生真菌不易辨認、挑取和分離。本實驗采取控制溫度法，控制溫度在23℃以保證真菌能分批次長出

31、。表面消毒是內生真菌分離研究中最關鍵的因素，其中消毒液濃度及消毒時間對植物內生真菌的存活有較大的影響。如果消毒液濃度過低、消毒時間過短，就不能有效地殺死植物表面的真菌和細菌，而消毒液濃度過大、消毒時間過長，則會導致一部分植物內生真菌被殺死。在文獻[4]中我們曾經使用有效氯濃度為2.5%次氯酸鈉消毒10 min，后來經過多次的實驗發(fā)現(xiàn)，有效氯濃度為2%的次氯酸鈉，消毒3 min 所得到的消毒效果較好，能有效地殺死植物表層細菌和真菌，又能較

32、大程度的保護植物內生真菌種類及數(shù)目的完整性。</p><p>　　內生真菌在植物中分布的種類和活性隨季節(jié)的不同而發(fā)生變化，不同的生長環(huán)境也影響內生真菌的種類和它的抗菌活性。在文獻[5]中用白菜黑斑病菌、蘋果腐爛病菌為測試菌對無花果植物內生真菌進行抗菌實驗，其結果與這次實驗不同，這與內生真菌的外部因素有關。本研究中所用的無花果植物樣品采自于秋季的同一個地方，由于季節(jié)和地點的影響，因此所分離的內生真菌的種類和其抗菌活

33、性有可能受到了一定的限制。以后將在不同的季節(jié)和不同的采樣地采集植物樣品，希望得到更多的活性內生真菌菌株。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 全國中草藥組. 中藥大辭典[M], 上海: 上海人民出版社, 1977. 345-346.</p><p>　　[2] 曹尚銀, 楊福蘭, 吳順. 無花果抗癌作用

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35、7): 1281-1285.</p><p>　　[5] 張弘弛, 馬養(yǎng)民, 劉瑞, 等. 無花果內生真菌的研究Ⅰ.抗植物病原真菌活性的篩選[J]. 西北農業(yè)學報, 2007,16(2):232-236.</p><p>　　[6] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海:上海科學技術出版社,1982: 129-649.</p><p>　　[7] H. L巴尼

36、特, B. B亨特著, 沈崇堯譯. 半知菌屬圖解[M]. 北京: 科學出版社, 1977: 41-197.</p><p>　　[8] B A R N E T T H L, B A R R Y B. Hunter illustrated genera of imperfect fungi[M].New York: Macmillan Publishing Company,1986:41-197.</p&g