轉GFP基因體細胞核移植克隆牛胚胎的研究.pdf

1、本文對提高轉基因體細胞核移植克隆牛早期胚胎發(fā)育進行了研究，目的是為了優(yōu)化體細胞核移植法生產轉基因克隆牛胚胎，以克服重構胚胎發(fā)育阻斷，為提高體外克隆轉基因胚胎的質量和數量提供理論基礎。本論文設計了五個試驗，分別為：試驗一探討了HYA(透明質酸酶)的濃度和作用時間對牛體外成熟卵母細胞脫卵丘及電激活參數對牛孤雌胚胎的影響；試驗二試驗采用脂質體轉染法與電穿孔法，以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)-新霉素抗性(neo-)雙標記基因的PMSCV質粒轉染胎

2、牛耳成纖維細胞為供體與體外成熟的牛卵母細胞為受體構建克隆胚，研究不同轉染方法構建供體細胞對重構胚發(fā)育的影響，并研究供體細胞的傳代次數對轉基因重構胚的影響；試驗三卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGF對轉基因核移植胚胎的發(fā)育影響；試驗四不同強度的電脈沖+乙醇+6-DMAP對牛轉基因重構胚的融合和激活，電融合液中鈣離子濃度對融合效果的影響；實驗五利用以上優(yōu)化方案生產轉基因克隆胚胎，研究轉基因重構胚在不同體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與培養(yǎng)體系中的發(fā)育效

3、果。 試驗結果如下：1.體外成熟培養(yǎng)液中添加EGF30ng/mL組卵母細胞成熟率最高，對轉基因重構胚的囊胚發(fā)育率，以添加EGF20ng/mL組最高。2.不同轉染方法轉染供體細胞構建重構胚，其囊胚發(fā)育率差異不顯著(P>0.05)，但脂質體轉染法效果較好。3.傳代5次的胎牛耳成纖維細胞做核供體，較有利于轉基因胚的發(fā)育。4.卵母細胞成熟培養(yǎng)22h，用0.20％HYA作用10min與0.50％HYA作用5min脫卵丘差異不顯著(P>0.