第五章-動物卵母細胞與胚胎冷凍保存技術

1、第五章 動物卵母細胞與胚胎的冷凍保存技術,河南農業(yè)大學 韓雪蕾,目 錄,第一節(jié) 卵母細胞與胚胎冷凍保存的意義與發(fā)展概況第二節(jié) 胚胎與卵母細胞的冷凍保存原理第三節(jié) 胚胎與卵母細胞的冷凍保存方法,,卵母細胞與胚胎的冷凍保存：是采取特殊的保護措施和降溫程序，是卵母細胞或胚胎在-196℃條件下停止代謝，使細胞處于新陳代謝和分裂速度停止，即使其發(fā)育基本處于暫時停頓狀態(tài)，而升溫后又不失去代謝恢復能力的一種長期保存胚胎和卵

2、母細胞的技術。,,第一節(jié) 卵母細胞與胚胎冷凍保存的意義與發(fā)展概況,(1)哺乳動物卵母細胞的有效冷凍保存是保護品種資源和拯救瀕危動物不可缺少的技術保障之一。 (2)是加快家畜品種改良和胚胎移植技術產業(yè)化的重要組成部分，可代替活畜進口，不受時間和空間的限制。 (3)可用于卵母細胞的低溫生物學特性和體外受精機理研究。,一、卵母細胞冷凍保存的意義,(4)通過冷凍保存卵母細胞，不但可以建立雌性動物的基因庫，還可以充分利用豐富廉價的卵母細胞

3、資源，使體外受精、轉基因及克隆等技術的研究應用不受時間和地域的約束。 (5)在醫(yī)學方面，人卵母細胞的冷凍保存可以克服胚胎冷凍保存所引起的倫理道德以及法律上的問題，為那些接受化療、放療或由于其它病理原因而過早摘除卵巢或輸卵管堵塞病人提供懷孕的機會。,,,二、卵母細胞冷凍保存的發(fā)展概況,卵母細胞的冷凍保存開始于1976年。1977年，Whittingham首次成功地冷凍保存了小鼠的成熟卵母細胞，受精后獲得了后代。隨后，Al-Hasan

4、等對兔卵母細胞冷凍保存后受精，移植后也得到了后代。家畜的卵母細胞冷凍保存主要集中在牛上，Lim等首次成功冷凍保存了牛的卵母細胞，且第一頭超低溫冷凍保存的卵母細胞產生的牛犢出生于1992年。,1998年，Vajita等首次采用OPS法冷凍牛卵母細胞取得了成功，體外受精后囊胚發(fā)育率達11％～25％。2002年Amir等結合微滴法和超低溫液氮的方法，取得了20%的囊胚率并獲得一頭健康小牛。,迄今為止，卵母細胞的冷凍保存以小鼠、牛為主要研

5、究對象，其冷凍方法趨于成熟，冷凍后的卵母細胞形態(tài)正常率、受精率、發(fā)育率及移植后的產仔率等方面均取得了一定進展。牛卵母細胞冷凍的研究主要集中在玻璃化方法的應用和尋求減少冷凍液體積和加快降溫速率的方法上，在低溫生物學機理和探討冷凍損傷的機理方面做的還不夠，因此，卵母細胞的冷凍保存條件及低溫生物學特性等方面還有待進一步研究。,二、胚胎冷凍保存的意義與發(fā)展概況,（一）胚胎冷凍保存的意義為建立優(yōu)良的動物胚胎庫和基因庫提供了條件；可使因疾病、

6、天災或戰(zhàn)爭等其他原因丟失的各種動物品種、品系和稀有突變體得以保持；可以控制品種內的遺傳穩(wěn)定性和維持某些近郊系動物的遺傳一致性，節(jié)約大量時間和資金；家畜胚胎庫的建立可實現(xiàn)簡便廉價的遠距離運輸胚胎，以代替運輸活畜，節(jié)約運輸和檢疫成本；減少因活畜運輸而傳播疾病的機會，促進了國際良種的交換。,（二）胚胎冷凍保存的發(fā)展概況,,胚胎的冷凍保存開始于1972年， 由Whittingham首次在小鼠上取得成功。此后，國外在牛（Wilmut等，1

7、973）、綿羊（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976）和馬（Ramamato等，1982）等動物的冷凍胚胎移植方面相繼取得成功。在國內，綿羊、兔、牛、山羊等動物凍胚移植也均獲得成功。目前，歐、美、日、加等國有上百家胚胎移植公司從事牛羊胚胎移植業(yè)務。在國內，牛的冷凍胚胎生產與移植已開始逐步商業(yè)化。,胚胎與精子細胞結構差異：胚胎數(shù)量極少胚胎體積比精子大很多(精子為9um,卵子直徑為120um),細胞質多

8、,外包特殊膜—透明帶。胚胎結構結構和新陳代謝過程更為復雜（精子為單細胞，胚胎為多細胞，受精卵隨第二極體的排出，新陳代謝逐步加強）。胚胎孕育著新的生命（嬌嫩）。,第二節(jié) 胚胎與卵母細胞的冷凍保存原理,一、卵母細胞和胚胎在低溫冷凍保存過程中的 受損機制卵母細胞的冷凍保存技術來源于胚胎冷凍保存，由于細胞自身所具有的一系列特殊性質，因而冷凍保存的難度較大。在冷凍保存及復溫過程中易受到一系列的損傷，主要包括在以下幾個方面：,1、細胞

9、內冰晶損傷胚胎與精子相比，含水量較高，而在冷凍過程中，有90 ％的水分形成游離水，而游離水易形成冰晶，從而破壞蛋白質的硫氫鍵，發(fā)生不可逆變化，導致細胞死亡。在胚胎及卵母細胞冷凍過程中，當溫度降低到冰點以下，在細胞外液內液都有冰晶產生，使細胞受到致命性的損傷（物理損傷），這個因素也是胚胎及卵母細胞冷凍保存的關鍵?？焖倮鋬鰰r，由于降溫速率快，結晶時的冰晶核較多，從而形成數(shù)目多且體積小的冰晶，對細胞造成的損害較小。,如果解凍時采取快速復

10、溫，則細胞仍能存活，但若在解凍過程中，在溫度較高的區(qū)域（如-40℃或更高）經(jīng)歷較長時間或進行慢速復溫，則會產生重結晶現(xiàn)象，即細胞內小冰晶重結晶成大冰晶，從而機械性的破壞細胞的超微結構而造成細胞的致命損傷。,2、細胞外冰晶損傷慢速冷凍時，冰晶首先在細胞外形成。細胞外液冰晶形成后，使得溶液中離子濃度的升高，對細胞產生了離子影響，此損傷又稱鹽損傷。隨著更多冰晶的產生，使溶液逐漸濃縮，溶液的濃縮對細胞的影響越來越大，此現(xiàn)象被稱為溶液效應又稱

11、為化學損傷。冷卻的速度越慢，則濃度越高，對卵母細胞的作用時間也越長，對卵母細胞膜蛋白復合體造成的傷害也越大。這主要是由于細胞內外的電解質濃度增高，導致細胞膜蛋白復合體的破壞和核膜的降解。,3、破裂損傷采用常規(guī)法冷凍的卵母細胞或胚胎解凍后可見到透明帶破裂，這主要是由于物質的膨脹率和收縮率不同，這種現(xiàn)象被稱作破裂損傷。由此可見，破裂損傷往往發(fā)生在液相和固相急速轉化的過程中。因此，慢速冷凍時緩慢通過冷凍液變相溫度區(qū)域非常重要。慢速解凍

12、法通常是以4～25℃/min的速率使胚胎由冷凍保存溫度逐漸升至室溫。,儲存于液氮內的細胞，需要解凍到常溫后才能應用。若升溫的速度不夠快，儲存的細胞從液氮溫度回升到成核溫度時，細胞會從周圍吸熱，熱力學發(fā)生變化后出現(xiàn)再結晶現(xiàn)象，即發(fā)生所謂的“去玻璃化”現(xiàn)象。去玻璃化過程有兩種類型：一種是原來降溫過程中形成的微小冰核在升溫的過程中形成冰晶；另一種是沒有微小冰核的標本中在復蘇的過程中形成冰核并結晶生長。,當溫度由-196℃升到-50～-1

13、5℃時，細胞內仍可能形成大冰晶而致死胚胎?？焖俳鈨龇ㄍǔ２捎脺厮》?，以300～360℃/min的速率使胚胎在30～40s內從-196℃迅速升至室溫。即將裝有胚胎的細管由液氮中取出，直接(或在空氣中停留5～10s)投入20～35℃的溫水中，10～20s即可完成解凍過程。這樣，可避免了細胞內大冰晶形成，從而有效地保護了胚胎。,當降溫速度很快時，胞質內水分形成的冰晶使細胞受到物理性的損傷。溫度過低會引起膜脂肪相的變化，從而影響細胞的新

14、陳代謝。采用合理的冷凍方法，添加適當?shù)睦鋬霰Ｗo劑，就能減少細胞在冷凍過程中的損害。,4、滲透壓損傷損傷主要來自解凍過程，卵母細胞或胚胎在冷凍液中平衡或脫出冷凍保護劑時，由于滲透壓的急劇變化而引起細胞過度膨脹或收縮使細胞受到損傷；同時滲透壓的急劇變化使大量水或冷凍保護劑快速通過細胞膜，而引起細胞膜機械性損傷。解凍時若將胚胎直接移入等滲溶液中，由于內部的滲透壓較高，水分很容易滲入細胞內，冷凍保護劑未來得及脫出，造成細胞膨脹而受到損傷。

15、所以，在脫出細胞內部冷凍保護劑的同時使細胞膨脹控制在最小程度。,5、冷凍保護劑化學毒性損傷當卵母細胞或胚胎移入冷凍保護劑液平衡時，隨著時間的延長和濃度的升高，生存率下降。造成這個結果的原因是冷凍保護劑中滲透性冷凍保護劑的化學毒性作用。冷凍過程中滲透性冷凍保護劑滲入細胞，影響和改變細胞內超微結構和大分子物質的結構和功能，間接引起高級結構的破壞。毒性表現(xiàn)在引起細胞膜變脆或破裂、透明帶硬化、微管及微絲聚合或解聚、染色體和DNA損傷等。,6

16、、低溫損傷卵母細胞和胚胎對溫度的降低極為敏感，在溫度高于冰點，細胞內外均無冰晶形成的情況下，仍會造成細胞的損傷。不同哺乳動物的細胞在低溫保存過程中都會受到一定的低溫影響，特別是脂質含量較多的豬卵母細胞和牛卵母細胞。這種由于溫度低于正常溫度所造成的細胞損傷被稱為低溫損傷。這種損傷很大程度上取決于溫度的變化。造成這種損傷的機理可能是的低溫引起膜脂肪相的變化，從而影響細胞的新陳代謝。低溫損傷與細胞質內脂肪顆粒的含量有關，如豬和牛卵母細

17、胞及早期胚胎此現(xiàn)象由為突出，其他哺乳動物脂肪含量較少，受低溫損傷影響不大。,7、過冷損傷冰晶的成核過程主要由熱力學條件決定。溶液在被冷卻到低于冰點的某一溫度時才開始結冰，在冷凍過程中溶液溫度降低到冰點以下是有可能回升到冰點的，對細胞產生損傷。如果溶液結冰的溫度離冰點有一定距離，如-15℃以下，由于潛熱的釋放使溶液溫度迅速上升，潛熱釋放完后又急劇下降，細胞往往在溫度的這種劇烈變化中死亡，所以在常規(guī)冷凍中，在稍低于溶液冰點，在-5℃時采

18、取人工植冰，使溶液瞬間度過冰點溫度，防止過冷損傷的發(fā)生。,二、原理：胚胎冷凍是利用低溫生物學原理，在胚胎冷凍前加入某些抗凍保護劑，在室溫下平衡脫水，并采用適宜的冷凍方法，避免在冷凍過程中胚胎細胞內大冰晶的形成及胞外溶液效應，達到有效冷凍胚胎的目的。冷凍過程中，要快速越過危險溫區(qū)（－50℃ ～－15℃ ）。,三、抗凍保護劑 1. 定義：是指一類可以保護細胞抵抗低溫或超低溫對細胞產生損害，如細胞內結冰、脫水、溶質濃度提高和蛋白質變性及

19、其骨架結構的損傷等。這類化合物稱作抗凍保護劑。當冷凍保護劑滲入到細胞內后，能增加整個細胞的粘度和細胞內的溶質濃度，干擾水分子的空間排列方向，使冰晶生長的驅動力減弱，晶體生長速率降低，從而降低細胞外液和細胞內容物的冰點，推遲冰晶的形成速度。在濃度增加到一定程度后，整個保存系統(tǒng)可以在相對較慢的冷卻速率下形成玻璃化，從而避免“胞內冰晶損傷”和“溶質性損傷”。,2. 分類 常用的抗凍保護劑可分為兩大類：（1）滲透性抗凍保護劑在溶液

20、中易結合水分子發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結晶過程。由于其容易透過細胞膜，進入細胞后，改變了細胞內過冷狀態(tài)，使細胞內壓接近于外壓，降低了細胞脫水引起的皺縮程度和速度，可使細胞內冰核形成的溫度下降至-40℃。通常也稱作細胞內液抗凍保護劑。主要 包括：丙三醇（甘油）、丙二醇、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺。這種冷凍保護劑的特點是：分子量為100以下，能夠透過細胞膜。,,（2）非滲透性抗凍保護劑 非滲透性抗凍保

21、護劑，可以通過改變細胞膜的通透性，減低冷凍過程中細胞內外的滲透壓差，防止由于溶液效應而使細胞脫水及蛋白質變性，在你一定溫度下使溶液結冰的部分縮小，從而降低細胞內、外溶質的濃度。通常也稱作細胞外液抗凍保護劑。包括：蔗糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FCS）、聚乙烯乙二醇（PEG）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 等。,（3）冷凍蛋白冷凍蛋白(Antifreeze Proteins，AFPS)最初是從極地海魚中發(fā)現(xiàn)的一類

22、抑制冰晶生長的蛋白質，它能通過阻止體液內冰核的形成與生長，維持體液的非冰凍狀態(tài)，使無體溫調節(jié)能力的生物在低溫的環(huán)境里得以生存。目前，在植物、昆蟲、細菌和真菌都發(fā)現(xiàn)并分離出冷凍蛋白，應用魚的冷凍蛋白已成功的玻璃化冷凍了牛和羊的胚胎及豬的卵細胞。其他一些學者報道，在常規(guī)冷凍方法中使用魚的冷凍蛋白對小鼠囊胚沒有影響，而在牛囊胚的玻璃化中使用植物的抗冷凍蛋白并沒有使解凍后的胚胎成活率提高，但是，移植后的妊娠率比添加牛血清蛋白的高。,3、減少

23、冷凍保護劑毒性的常用方法包括：①使生物標本在高濃度的冷凍保護劑中暴露的時間盡可能短、溫度盡可能低。②選擇合適的冷凍保護劑。③對某些冷凍保護劑選用特定的毒性中和劑，如在DMSO中加入適量的甲酰胺、乙酰胺可大大降低其生物化學毒性。高濃度的冷凍保護劑也會導致細胞內外的滲透壓差過大。由于冷凍保護劑穿透細胞膜的速率比水要小，因此加載冷凍保護劑的最初反應是細胞內水分的滲出，同樣，在生物標本中移出冷凍保護劑時，細胞外的水分要滲入。,盡管細胞內

24、外的水分、冷凍保護劑相互滲透并最終達到平衡，細胞體積的過度變化將導致細胞失活。因此在玻璃化冷凍保存細胞、組織的過程中應逐步加載、移出冷凍保護劑，以減少細胞內外的滲透壓差。要實現(xiàn)玻璃化冷凍保存，需要針對不同的生物標本對冷凍保護劑的種類，濃度進行篩選并確定相應的加入、移出方式。,4、除去冷凍保護劑的方法：（1）、逐步稀釋法用濃度遞減的保護液逐步稀釋，使冷凍保護劑脫除。此方法比較繁瑣，但效果好，目前普遍采用此方法。（2）、非滲透性溶

25、液脫除法應用較高濃度的非滲透性保護液經(jīng)一步或兩步脫除保護劑。將解凍后的胚胎移入含有高濃度的非滲透性保護液中，有助于脫除冷凍保護劑而不產生新的滲透性損傷。此法常以蔗糖作溶質，蔗糖是非滲透性雙糖，在稀釋細胞內保護劑時起緩沖滲透壓的作用，防止水分大量滲入細胞而引起過度膨脹。,（3）、細管內脫出冷凍保護劑1983年SP.Leibo等提出一步細管法，冷凍時將冷凍保護劑及解凍液定量分裝在細管內的不同部位，解凍時使胚胎解凍和脫除冷凍保護劑一步完成

26、，解凍后可直接進行移植。目前人們對這一方法繼續(xù)進行研究，試圖找出無需脫除即可直接移植的冷凍保護劑。對于玻璃化冷凍的胚胎，在細管中間裝入三段玻璃化液，中間段含胚胎，其余部分為稀釋液。解凍后手捏封口端搖晃均勻，然后直接移植，細管內的保護液可起到雙重作用：稀釋胚胎內的保護劑有利于胚胎復水；降低輸入子宮內的保護劑濃度，從而減少對子宮內膜的刺激作用。,第三節(jié) 胚胎及卵母細胞的保存方法,鮮胚移植存在的問題：移植時供體和受體間的同期化與數(shù)量配

27、比很難恰到好處；鮮胚體外存活時間段，要求供、受體位于同一牧場內，或同一區(qū)域范圍內，不利于商業(yè)化。胚胎保存：是指將胚胎在體內外正常條件下，暫時儲存起來而不失去活力，或者將其保存于低溫或者超低溫情況下，使細胞新陳代謝和分裂速度減慢或停止，發(fā)育處于暫時停滯狀態(tài)，一旦恢復正常發(fā)育條件，又能繼續(xù)發(fā)育。,一、胚胎的保存方法 （一）、異種活體保存并不是任何動物的胚胎都能在另一種動物的輸卵管或子宮內存活，研究發(fā)現(xiàn)家兔輸卵管比較適于其他動物早期胚

28、胎的保存。利用家兔保存異種動物胚胎的優(yōu)點：（1）輸卵管有分泌粘蛋白的機能，附著在胚胎周圍，可以保護胚胎抵御不利因素的影響；（2）家兔輸卵管的化學組成，其中能源物質和氨基酸的組成以及蛋白質的比例等，有利于異種動物胚胎的發(fā)育。,牛原核~8細胞期可在結扎的家兔輸卵管中保存3~4d；羊2~4細胞胚胎保存3d；馬桑椹胚和早期囊胚可保存2d；豬8~16細胞可保存1~3d。缺點：胚胎容易丟失或吸收，回收率較低。,,為避免胚胎損失或丟

29、失，可將胚胎在1%瓊脂液中包埋，胚胎封入圓形瓊脂小柱中，在移植到家兔輸卵管中保存。,,,（二）、常溫保存常溫保存是指胚胎在15～25℃溫度下于培養(yǎng)液中保存，可保存24h，隨著時間的延長，活力下降，因此只能做短暫的保存和運輸。,（三）、低溫保存低溫保存是指在0～5℃的區(qū)域內保存胚胎的一種方法。此時，胚胎卵裂暫停，代謝速度顯著減慢，但尚未停止。各種哺乳動物適宜保存的參考溫度分別是： 小鼠：5～10℃ ，家兔：10℃ ，綿羊

30、：10℃ 山羊：5～15℃ ， 牛：0～6℃ 優(yōu)缺點：保存時間相對比較短，但操作方便，設備簡單，適于野外應用。,（四）超低溫冷凍保存1、慢速冷凍法此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎冷凍研究中常用的方法。該法將胚胎置于冷凍保護液中以0.2~0.8℃/min的速率緩慢降溫至-80℃，然后投入液氮保存。利用這一方法先后對多種家畜和實驗動物的胚胎進行冷凍試驗并取得成功。由于其冷凍過程花費的時間比較長（6

31、h以上），而且需要特殊的冷凍降溫設備，因此目前已經(jīng)很少采用。,2、快速冷凍法：又稱常規(guī)冷凍法。將胚胎移入含有低濃度抗凍劑的冷凍保存液中，通過程序冷凍控制儀使胚胎緩慢降溫，以誘導胚胎外液形成冰晶，胚胎內形成玻璃化狀態(tài)，而使胚胎存活的技術。該法一般使用混合保護液，由濃度為0.2～3.5 mol/l滲透性的保護劑如丙二醇與濃度為0.25～0.5 mol/l的非滲透性的保護劑如蔗糖混合而成。胚胎凍前脫水，使細胞內水分減少，冰晶量及大塊冰晶形

32、成減少，可以獲得較高存活率。,快速冷凍法是通過冷凍程序儀來控制其降溫速率，一般以1℃/min左右的速率降至-7℃左右時，進行人工誘導結晶，再以0.1~1.0℃/min的速率降至-30~-40℃（快速冷凍）或者-80℃（慢速冷凍）時，投入液氮中保存。解凍：從液氮中取出后，在空氣中停留10~15s，使胚胎通過易破裂的溫度域（-110~-130℃ ），然后投入35℃水浴中，并輕輕地水平脫除冷凍保護劑，將胚胎移至保存液中洗滌3~5次，對胚胎

33、進行鑒定，后移植。,,優(yōu)點：將水從細胞中脫出的速度和水結成冰的速度達成了平衡狀態(tài)，是目前最為常用的胚胎冷凍保存方法；缺點：需要價格昂貴的程序化冷凍儀。,3. 玻璃化冷凍法：將胚胎放入高濃度抗凍劑的冷凍保存液中，通過快速降溫使胚胎內外溶液形成玻璃化狀態(tài)，從而阻止胚胎內冰晶形成時造成的物理和化學損傷。玻璃化：是指當水或溶液快速降溫達到或低于-100～-110℃的溫度范圍時，形成一種具有高粘度的介于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體態(tài)、雜亂無章、透

34、明的玻璃狀態(tài)（不形成冰晶而由液態(tài)直接變?yōu)橥该鞯陌牍虘B(tài)再過渡為固態(tài)的現(xiàn)象）。玻璃態(tài)的物理性能與晶體不同，是一種即可以避免或減輕冷凍細胞、組織損傷，又可長期保存細胞、組織的良好方法。,配制的高濃度冷凍保護液在液氮中能形成類似玻璃狀穩(wěn)定而透明的非晶體化固體物質狀態(tài)。其特點為：①分子不按晶格結構排列，為無定型結構。②在玻璃化過程中，分子不重新排列，發(fā)生劇烈運動，沒有準確固定的轉變固化點，其形態(tài)的轉變是在一定的溫度區(qū)內完成的，即玻璃化變相溫

35、度是代表一個區(qū)域的溫度。③當水溶液有電解質或其他可溶性成分轉變成玻璃態(tài)時，由于其均一的分散系統(tǒng)未遭到破壞，所以溶液的濃度發(fā)生改變或改變很小,優(yōu)點：是超快速降低細胞溫度的一種冷凍模式，因為冷凍液在液氮中形成的是一種非晶體物質狀態(tài)，因而避免了慢速冷凍過程中細胞所遭受的機械損傷，同時縮短了冷凍處理所需的時間，簡化了步驟，也不需要昂貴的程序降溫儀，逐漸成為胚胎和卵母細胞冷凍的趨勢。缺點：高濃度的冷凍保護劑對細胞有較大的化學毒性，在操作時間上

36、不易掌握。因此，在具體實施玻璃化冷凍時，要注意保護劑濃度和作用時間的平衡，既要使細胞質充分脫水，又不能作用時間過長，或者進一步尋找開發(fā)容易實現(xiàn)玻璃化且對細胞損傷較小的防凍劑。,根據(jù)采用不同的材料和處理方法分為：OPS法（Open Pulled Straw，OPS—開放式細管）；冷凍環(huán)（Cryo-loop）法；電鏡銅網(wǎng)法；玻璃微細管法；封閉式細管法。,（1）OPS法：利用0.25ml細管，在107℃左右對細管的中間7～8cm處

37、加熱，兩手輕拉細管至24cm以上長度，截去兩頭粗的一端，用刀片在中間切斷，即可得到兩段細管。利用細管的虹吸作用將含有胚胎或卵母細胞的微量玻璃化液吸入細管內，然后直接投入液氮中冷凍保存。OPS法降低了細管壁厚度，加快了溫度的傳導，提高了表面積/體積比值，提高了致冷率，加快了降溫速度，降溫速度可達到2000℃/min以上，從而降低了冷凍時的損傷。目前，已經(jīng)利用這種方法成功的對小鼠、兔子、牛、綿羊、山羊、等家畜胚胎和卵母細胞進行了冷凍。,

38、（2）冷環(huán)法（Cryo-loop）：以尼龍膜環(huán)作為胚胎或卵母細胞的承載工具。具體操作為：先將胚胎在冷凍保護劑中處理，然后將胚胎移到附有玻璃化液的尼龍膜環(huán)（Φ0.5-0.7mm）上，將環(huán)投入液氮中。胚胎接觸玻璃化液到投入液氮的時間約為20～30s。此法具有與OPS法相似的降溫速度，最先在小鼠和人囊胚上應用，采用此法冷凍的人囊胚移植后已經(jīng)成功產出嬰兒。目前，以用此法成功地冷凍保存了馬、獼猴的胚胎。,（3）電鏡銅網(wǎng)法：以電子顯微鏡銅

39、網(wǎng)作為胚胎或卵母細胞的承載工具，采用小體積冷凍液（<1μl）和液氮直接接觸，冷凍速率達到3000℃/min。具體操作為：胚胎或卵母細胞在冷凍液中處理一定時間后，將它們和冷凍液移到電子顯微鏡銅網(wǎng)上，然后用鑷子夾住銅網(wǎng)，直接浸入液氮。1996年Martino等采用該法冷凍保存牛卵母細胞，解凍后形態(tài)正常率近60％，體外受精后卵裂率和囊胚率分別為29％～32％和10％～15％。,（4）玻璃微細管法：以毛細玻璃管拉制成直徑為0.3mm

40、玻璃微細管作為卵母細胞或胚胎的承載工具，具體操作類似于OPS法。玻璃的導熱性能比塑料好，而且直徑小重量較大，能夠克服OPS法在冷凍時漂浮在液氮面上的缺陷，冷凍速度要高于OPS法。,（5）細管法：以0.25ml細管作為胚胎或卵母細胞的承載工具。1991年Kono等用含有二甲基亞砜、乙酰胺、丙二醇和聚乙稀EG的冷凍保護劑對小鼠卵母細胞進行冷凍保存，使用0.25ml塑料細管作為載體，投入液氮冷凍保存。解凍后正常受精率達80％～87％，有

41、69％～78％發(fā)育至囊胚。1993年Wood等也是用0.25ml塑料細管作為載體冷凍小鼠卵母細胞。與Kono等不同的是細管在液氮蒸汽熏蒸3min后投入液氮冷凍保存，解凍時先進行10s空氣浴(20℃)，然后20℃水浴10s。體外受精后培養(yǎng)，分裂率為91％，移植妊娠率為79％。,玻璃化冷凍法的技術關鍵 玻璃化冷凍的關鍵是胚胎在玻璃化液中脫水并形成玻璃化。玻璃化液是以PBS液為基礎液，添加高濃度的滲透性抗凍保護劑配制而成。加入

42、非滲透性抗凍保護劑的作用：一方面對溶液形成玻璃化具有促進作用。另一方面，還可以降低滲透性抗凍保護劑的濃度，限制其過量滲入胚胎內部。,4、微滴法將含有胚胎的冷凍液直接滴入液氮，冷凍速率將會得到極大提高，這便產生了微滴法。具體操作為：在冷凍過程中，將含有胚胎的體積約為6μl的冷凍液小滴直接滴入液氮中，然后用鑷子將冷凍液形成的顆粒集中到小管中保存。解凍時將冷凍顆粒直接投入解凍液中，顆粒融化后收集胚胎并按程序脫出冷凍保護劑。朱士恩等用微

43、滴法冷凍保存小鼠擴張囊胚，解凍后的存活率達100%，移植后產仔率達到71%。,二、卵母細胞的冷凍保存方法 與胚胎的冷凍保存方法相同，采用： 常規(guī)冷凍法與玻璃化冷凍法,小鼠,羊,兔,牛,玻璃化冷凍卵母細胞作為核受體的體細胞克隆牛,卵母細胞在超低溫冷凍中容易受損部位,膜結構 ：質膜內陷、破裂，胞質與透明帶相連，微絨毛數(shù)量減少或消失，線粒體分散、膨大，內質網(wǎng)囊池擴張，高爾基復合體消失，細胞基質出現(xiàn)空白區(qū)等現(xiàn)象。染色體

44、：處于MII期的成熟卵母細胞其染色體松散地附著在紡錘體上，缺少包被的核膜對低溫相當敏感。細胞骨架對微絲的影響微絲是由聚合肌動蛋白和自由肌動蛋白組成，它對紡錘體旋轉、極體排出、原核遷移和胞質分裂是必需的。正常情況下，兩種肌動蛋白保持平衡，但冷凍保存可能破壞這種平衡,對微管的影響卵母細胞中的微管主要是參與紡錘體形成。正常情況下，胞質中的微管由α管蛋白和β管蛋白結合組成。微管對溫度敏感，0~4℃可引起微管的解降，,人腔前期卵母細胞冷凍