降鈣素對卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用及機制.pdf

1、第一部分降鈣素對卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用
　　目的：建立卵巢切除合并椎體融合大鼠模型并給予鮭魚降鈣素（ salmon Calcitonin, sCT）干預，在證實該模型誘發(fā)融合部位相鄰節(jié)段椎間盤退變的基礎上，初步探討降鈣素對該模型的椎體融合及椎間盤退變的影響。
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側卵巢切除術（Ovariectomy，OVX，30只）或

2、假手術（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術（ Posterolateral lumbar fusion，PLF），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射 sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/kg隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受Sham+V、OVX+V、PLF+V及 OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對照。脊柱融合后

3、12周，處死動物并取出L3~6節(jié)段及其椎間盤。先采用手法評估及X線評估融合情況，再磨鉆分離雙側L4~5橫突間融合部位并分離L5~6椎間盤及相鄰椎體，進行脫鈣、包埋、切片以及染色。對 L5~6椎間盤進行van Gieson染色觀察相鄰節(jié)段椎間盤退變情況并進行組織學評分。同時基于VG染色圖像測量對椎間盤高度、終板厚度及終板鈣化面積比等進行測量和分析。
　　結果：
　　1融合情況評估
　　手法檢測結果：對接受 PLF手術的大

4、鼠（PLF+V、OVX+PLF+V和 OVX+PLF+sCT組）檢查發(fā)現(xiàn)棘突纏繞的鋼絲完整且固定良好。所有進行PLF的大鼠均未檢測到融合節(jié)段的活動。
　　X線攝片分析結果：與 PLF+V組和 OVX+PLF+sCT組比較， OVX+PLF+V組融合部位密度較低，融合進程延遲。評分結果示：OVX+PLF+V組顯著低于PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　2椎間盤退變組織學觀察及相關定量參數(shù)分析
　　組織學觀察及評

5、分：Sham+V組脊索細胞及髓核細胞外基質(zhì)較豐富纖維環(huán)排列整齊，終板軟骨層較多。OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組髓核、纖維環(huán)和終板表現(xiàn)出均有退變表現(xiàn)，包括脊索細胞數(shù)量減少并被軟骨樣細胞取代，尾側髓核有粘液樣改變。纖維環(huán)與髓核邊界模糊，膠原丟失，排列紊亂。軟骨終板有不同程度鈣化。OVX+PLF+V組退變較OVX+V組和PLF+V組更明顯。組織學退變評分結果：OVX+V組、PLF+V組、 OVX+PLF+V組和OVX+PLF

6、+sCT組均顯著高于Sham+V組（P<0.05），OVX+PLF+V組顯著高于其余各組（P<0.05）。
　　椎間盤退變相關定量參數(shù)分析：OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組椎間盤高度明顯低于Sham+V組（P<0.05），而終板厚度和終板鈣化面積比率明顯高于Sham+V組（P<0.05）。然而，經(jīng)降鈣素干預12周后， OVX+PLF+sCT組大鼠椎間盤高度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05），而終板厚度和終

7、板鈣化面積比率顯著低于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　　OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組椎間盤高度顯著低于Sham+V組，終板厚度和鈣化面積比顯著高于Sham+V組，OVX+PLF+V組椎間盤高度顯著低于其余各組，終板厚度和鈣化面積比顯著高于其余各組。OVX+PLF+sCT椎間盤高度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05），終板厚度和鈣化面積比顯著低于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　

8、　結論：脊柱融合手術和雙側卵巢切除均可誘發(fā)大鼠椎間盤退變，接受兩種造模手術較單一造模退變更加嚴重，該模型可用于模擬人類絕經(jīng)后椎體融合術誘發(fā)的椎間盤退變，降鈣素早期皮下注射能夠延緩相鄰節(jié)段椎間盤退變。
　　第二部分降鈣素對卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤Col~I、Col~IIAggrecan、MMP~13和ADAMTS~4表達的影響
　　目的：通過分析椎間盤 Col~I、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和A

9、DAMTS~4的表達及降鈣素對其表達的影響，探討卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤基質(zhì)代謝的增齡性變化及降鈣素的作用。
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側卵巢切除術（Ovariectomy，OVX，30只）或假手術（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術（Posterolateral lumbar fusion，PLF

10、），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/kg隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受Sham+V、OVX+V、PLF+V及 OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對照。脊柱融合后12周，處死動物并取出L3~6節(jié)段及其椎間盤，分離L5~6椎間盤及相鄰椎體，進行脫鈣、包埋、制備石蠟切片，經(jīng)免疫組織化學染色檢測各組L5~6椎間盤髓核和纖維環(huán)中Col~I、

11、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和ADAMTS~4表達情況，應用 Image pro~Plus6.0軟件對免疫組化陽性蛋白表達情況進行積分光密度(integrated optical density, IOD）計算，定量分析各組L5~6椎間盤中陽性細胞表達差異。
　　結果：
　　免疫組織化學染色結果示 Col~I、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和ADAMTS~4在纖維環(huán)和髓核均有陽性表達，著色淺

12、黃或棕黃色不等，具體表達情況如下：
　　Col~I：免疫組織化學染色及 IOD分析結果示 Col~I在髓核及纖維環(huán)中表達趨勢相同，Sham+V組表達水平最低，OVX+PLF+V組表達水平最高，兩兩比較結果：OVX+V組、 PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著高于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　Col~II：免疫組織化學染色及IOD分析結果示Col~

13、II在髓核及纖維環(huán)中表達趨勢相同，Sham+V組表達水平最高，OVX+PLF+V組表達水平最低，兩兩比較結果：OVX+V組、 PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著低于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著低于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　Aggrecan：免疫組織化學染色及 IOD分析結果示 Aggrecan在髓核及纖維環(huán)中表達趨勢相同，Sham+V組表達水平最高，OVX+PLF+V組表達水平

14、最低，兩兩比較結果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著低于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著低于OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　MMP~13：免疫組織化學染色及 IOD分析結果示 MMP~13在髓核及纖維環(huán)中表達趨勢相同，Sham+V組表達水平最低，OVX+PLF+V組表達水平最高，兩兩比較結果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于Sham+V組，OVX+

15、PLF+V組顯著高于OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　ADAMTS~4：免疫組織化學染色及 IOD分析結果示 ADAMTS~4在髓核及纖維環(huán)中表達趨勢相同， Sham+V組表達水平最低， OVX+PLF+V組表達水平最高，兩兩比較結果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于 Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著高于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　

16、結論：卵巢切除合并椎體融合大鼠相鄰節(jié)段椎間盤組織中Col~IIAggrecan等基質(zhì)成分丟失，椎間盤組織中 Col~I、MMP~13和ADAMTS~4水平升高，降鈣素干預可抑制這一進程，提示降鈣素可通過調(diào)控基質(zhì)代謝抑制該模型椎間盤退變。
　　第三部分降鈣素對卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎體骨密度和微觀結構的影響
　　目的：通過骨密度檢測及micro~CT分析探討降鈣素對卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰椎體骨骨量和微觀結構的影響。

17、
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側卵巢切除術（Ovariectomy，OVX，30只）或假手術（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術（Posterolateral lumbar fusion，PLF），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/

18、kg，隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受 Sham+V、OVX+VPLF+V及OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對照脊柱融合后12周，處死動物并取出L3~L6節(jié)段及其椎間盤，經(jīng)雙能X線骨密度儀檢測L3~L6骨密度，Micro~CT分析L6椎體松質(zhì)骨微觀結構，感興趣區(qū)為距離兩側生長版1mm至4mm范圍松質(zhì)骨，直徑1.5mm的圓柱體，測算椎體骨小梁骨量及結構數(shù)據(jù)，包括：骨密度、相對體積（ bone volume/trab

19、ecular volume, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、結構模型指數(shù)（Struc~ture Model Index, SMI）。
　　結果：
　　1 L3~L6骨密度：任意兩組間比較，L3~L6骨密度表現(xiàn)出相同的趨勢，OVX+V組和 OVX+PLF+V組骨密度分別顯著低于 Sham+V組和PLF+

20、V組（P<0.05），OVX+PLF+sCT組骨密度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　　2 Micro~CT分析結果：骨密度、BV/TV, Tb.Th和Tb.N各組間比較結果趨勢相同：OVX+V組顯著低于Sham+V組（P<0.05）；OVX+PLF+V組顯著低于PLF+V和OVX+PLF+sCT組（P<0.05）。Tb.Sp和SMI各組間比較結果趨勢相同：OVX+V組顯著高于Sham+V組（P<0.05）；OVX