人皮膚干細胞誘導分化構建人工結膜的實驗研究.pdf

1、眼表包括健康的眼表上皮細胞和完整的淚膜。其中，眼表上皮細胞又包括角膜上皮細胞和結膜上皮細胞，二者的健康狀態(tài)不僅可保障正常的眼表功能，還有維持完整淚膜的重要作用。通常，在外露的角膜上皮和結膜上皮表面被覆著薄層的淚膜。淚膜不僅構成眼球與外界環(huán)境的交界面而且還形成保護角膜和結膜的屏障。淚膜中適量的電解質、蛋白、黏液和磷脂等成分不僅可維持角膜的透明性，還可保證角膜上皮細胞和結膜上皮細胞的健康狀態(tài)。當眼表遭到諸如：干燥、強光、嚴寒、機械性刺激、物

2、理性損傷、腐蝕性化學傷以及細菌性、病毒性和寄生蟲性的感染時，均可引起應激性的淚膜變化。此外，淚膜不僅對外源性的各類刺激產(chǎn)生應激性反應，還有維持眼表上皮細胞內(nèi)源性需要的作用，而眼表上皮細胞的健康狀態(tài)也可直接影響到淚膜的狀態(tài)。所以淚膜的成分、結構和分泌量都受到多因素的影響。此外，淚膜所構成的穩(wěn)定液體膜不但可保護、維持健康的角膜和結膜上皮細胞，而且還可確保透明角膜提供清晰的視光學區(qū)。 在人類眼表由于結膜的表面積為角膜表面積的17倍，當

3、其受到物理或化學損傷時，不但嚴重破壞眼表上皮的完整性和分泌功能，還可造成結膜的粘連和瘢痕形成，從而造成眼表的嚴重損壞。目前，雖然有自體結膜移植、唇粘膜移植、異體羊膜移植等治療方法的報告，但是自體結膜來源受限，唇粘膜和異體羊膜缺乏結膜組織的功能，效果欠佳。因此需要我們開發(fā)出一種在組織學形態(tài)及生物功能上都接近結膜組織的生物材料作為治療眼表損傷的結膜移植替代物。 干細胞是一類存在于皮膚、骨髓、肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等許多組織中、并具有高度

4、增殖潛能和無限自我更新能力的細胞亞群，能自我更新并長期維持組織結構的穩(wěn)定性，體外培養(yǎng)條件下或創(chuàng)傷時被激活，并開始增殖、再生以重建組織，具有高度的增殖潛能。與其他組織的干細胞相似，表皮的角質形成細胞干細胞(keratinocytestemcells，KSC)不僅對于皮膚組織的自身穩(wěn)定和創(chuàng)傷愈合具有重要作用，而且具有上皮性始祖細胞的功能。目前對KSC的研究已取得較大進展，表皮是一種分層、快速更新的組織，角質形成細胞(KC)的再生是由基底層內(nèi)

5、干細胞和短暫擴增細胞(transitamplifyingcells，TAC)兩種增生細胞的特殊體系來完成的。此外，有學者報道：在外胚層器官發(fā)育過程中，皮膚的上皮細胞與眼表上皮細胞(結膜、角膜、淚腺等)均來源于同一胚層，具有高度的同源性。 基于上述，本研究進行了以下方面的工作：人皮膚干細胞體外誘導分化構建人工結膜的實驗研究 目的：觀察皮膚干細胞在結膜去細胞基質膜上的生長和分化情況，探討利用皮膚干細胞及結膜去細胞基質膜構建人

6、工結膜的可能性。 方法：將體外分離培養(yǎng)的1～2代人皮膚干細胞接種于人結膜去細胞基質膜上，在體外觀察細胞的分化情況。標本分別行HE染色、人上皮細胞角蛋白K19單克隆抗體、結膜上皮細胞特異性標記蛋白K8抗體、K13抗體、MUC5A/C抗體免疫組化鑒定。 結果：皮膚干細胞在結膜去細胞基質膜等模擬的體外微環(huán)境下可形成類似結膜上皮細胞的復層增生，并有類結膜上皮細胞特異性標記蛋白表達，呈K8抗體、K13抗體、MUC5A/C抗體表達陽

7、性。 結論：利用皮膚干細胞可在體外模擬的微環(huán)境下分化構建人工結膜，用于結膜移植眼表重建。 人工結膜組織生物學特性檢測的實驗研究 目的：檢測經(jīng)誘導分化后的類結膜上皮細胞中β-2-microglobulin、keratin13基因的表達及人工結膜組織中特異性蛋白(CK13、MUC5AC)的表達情況。 方法：試驗組細胞以結膜上皮細胞為飼養(yǎng)細胞進行共培養(yǎng)，并設立空白對照組細胞培養(yǎng)相同時間，分別于第1、3、5、7日

8、取各組細胞提取RNA進行實時RT-PCR定量檢測各組β-2-microglobulin、keratin13基因的表達情況；并用免疫印記的方法檢測體外構建人工結膜組織膜中是否有結膜特異性CK13及MUC5AC蛋白的表達。 結果：試驗組細胞共培養(yǎng)3天后出現(xiàn)β-2-microglobulin、keratin13基因的表達，5、7天的表達量顯著提高；經(jīng)體外構建10天、20天的人工結膜都有與正常結膜組織相同的CK13和MUC5AC蛋白的表

9、達。 結論：經(jīng)本實驗方法構建的人工結膜組織膜具有與正常結膜組織相似的分子生物學特性。 人工結膜體內(nèi)移植的動物實驗研究 目的：將人工結膜組織移植于試驗動物眼表，觀察移植后的人工結膜在動物體內(nèi)的誘導、分化結果。 方法：新西蘭白兔20只，隨機分為4組，完全剪除右眼球結膜，并在上方鞏膜處植入人工結膜組織，分布于1、2、3、4周后取移植的人工結膜組織行冰凍切片，標本分別行PAS染色、人結膜上皮細胞特異性標記蛋白K1