基于DNA條形碼的細小種子類及含靛玉紅類中藥材的鑒定研究.pdf

1、我國藥用動植物資源豐富，2010年版《中國藥典》收錄的中藥多達600多種。然而由于南北差異和歷史沿革等原因，同名異物的混淆品或代用品極多，嚴重影響了中藥材的臨床療效和用藥安全，一直是中藥產(chǎn)業(yè)化、國際化的主要挑戰(zhàn)之一。DNA條形碼技術在解決這一問題上擁有自己獨特的優(yōu)勢，2010年版《中國藥典》增補本已收錄中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則。本文以《中國藥典》收錄的直徑小于2毫米的細小種子類中藥材和含靛玉紅類中藥材為研究對象，基于ITS2序

2、列探討中藥材DNA條形碼分子鑒定法在實際鑒定工作中的操作流程及實際應用價值，得出以下結論：
　　（1）本實驗以直徑小于2毫米的車前子、青葙子、天仙子、葶藶子、菟絲子和王不留行6種細小種子類中藥材及其混偽品為研究對象，共包含28個物種144份實驗材料。用試劑盒法提取細小種子類中藥材及其混偽品的144份樣本的總DNA，通過PCR擴增其ITS2序列并雙向測序。應用CodonCode Aligner v4.25對測序峰圖進行校對拼接，去除

3、低質量序列及引物區(qū)獲得ITS2序列。用MEGA6.0軟件計算物種種內和種間的K2P遺傳距離，分析變異位點并構建鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹。綜合應用相似性搜索法、最近距離法以及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹等進行鑒定分析。結果顯示，144份樣本的ITS2序列的擴增效率和測序成功率均為100％，6種中藥材9個基原物種的ITS2序列長度范圍為194~221 bp?；谙嗨菩运阉鞣ǎ琁TS2序列鑒定效率為88.9%?；贙2P模型計算遺傳距離，平車前、車前、青葙、

4、天仙子、獨行菜、播娘蒿、菟絲子、南方菟絲子、麥藍菜9個物種的最大種內遺傳距離分別為0.005、0、0.009、0.005、0.010、0.021、0.005、0.034、0，小于9個物種的最小種間遺傳距離0.047；平車前、車前、獨行菜、播娘蒿、菟絲子、南方菟絲子和天仙子的最大種內遺傳距離小于其與其混偽品的最小種間遺傳距離；青葙的最大種內遺傳距離等于其與其混偽品的最小種間遺傳距離。NJ樹圖結果顯示，除平車前和青葙外，其余的7個物種均能各

5、自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性，與混偽品明顯的區(qū)分開。雖然基于NJ樹圖法，ITS2序列不能很好的區(qū)分平車前及其偽品大車前，但相似性搜索法和最近距離法的結果均證明ITS2序列能夠鑒別平車前及其混偽品。因此，ITS2序列能夠準確鑒別除青葙子以外的5種細小種子類中藥材，為保障臨床用藥安全提供了有效的技術手段。
　?。?）本實驗共收集57份菘藍、蓼藍、馬藍及其混偽品的樣本。隨機挑選24份菘藍、蓼藍、馬藍及其混偽品樣本，并對其matK、rb

6、cL、psbA-trnH和ITS2序列進行PCR擴增和測序，比較各序列擴增成功率、測序成功率、鑒定能力，結果顯示ITS2序列是最理想的DNA條形碼；PCR擴增和測序剩余的33份樣品的ITS2序列，分析其種內、種間遺傳距離，構建NJ系統(tǒng)聚類樹。最小距離法及NJ系統(tǒng)聚類樹圖均表明 ITS2序列能準確鑒別菘藍、蓼藍、馬藍及其混偽品。另外，本研究應用高效液相色譜法檢測菘藍、蓼藍、馬藍及其混偽品大青、木藍、水蓼、火炭母、球花馬藍以及中藥材青黛等3