簡介：＼793181四川碩士學學校代碼10610學號S021987大學位論文作專二OO五年四月二十日四JIL大學碩士學位論文強迫癥認知功能的家系研究碩士研究生；李斌導師楊彥春教授中文摘要研究目的①通過對強迫癥患者及其一級親屬進行認知功能測評，探討強迫癥患者及其一級親屬在智力、記憶、注意及執(zhí)行功能方面的特征是否存在認知功能缺陷；②通過對強迫癥患者、一級親屬及正常對照認知功能比較，探討強迫癥認知功能損害是否具有家族聚集性，是否可以作為強迫癥遺傳易感基因的“內(nèi)表型”，為強迫癥的遺傳病因?qū)W提供神經(jīng)心理學依據(jù)。研究方法對40例首發(fā)或未服藥強迫癥患者、48例一級親屬分別與40例患者對照和47鍘親屬對照采用神經(jīng)心理學測驗包括知識、算術(shù)、數(shù)字符號、木塊拼圖、邏輯記憶、視覺記憶、S訂OOP測驗、連線測驗、言語流暢性測驗、漢諾塔和威斯康星卡片分類{曰4驗修訂版進行神經(jīng)認知功能評定；采用YBOCS、HA仍和HAMA對強迫癥患者進行臨床表現(xiàn)和嚴重程度評定。結(jié)果1強追癥患者存在記憶、注意和執(zhí)行功能方面的認知損害，強迫癥患者在即刻邏輯記憶P0．01、延遲邏輯記憶PO．01、即刻視覺記憶P0．01、延遲視覺記憶PO．01、STROOP．C糾正數(shù)P0．01、劃痕測驗B時間P0．05、漢諾塔計劃時間PO．05和執(zhí)行時NP0_01

簡介：點擊查看更多攜帶大鼠Foxp3基因慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的通過臨床試驗研究，評價益艾康膠囊治療艾滋病患者HIVAIDS的客觀效果，并通過改善患者臨床癥狀和體征，提高CD4和CD4CD8比值，減少各種機會性感染的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量，進一步驗證或揭示中醫(yī)藥的作用機制和科學內(nèi)涵。方法病例取自河南駐馬店汝南縣農(nóng)村地區(qū)。選擇HIVAIDS80例，所有HIV感染者均被河南疾控中心確診，感染途徑均為19901995年之間的有償獻血感染。我們對病例按11隨機分為兩組。將符合納入標準的HIVAIDS患者，隨機分為治療組及對照組，治療組給予益艾康膠囊聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HAART治療，對照組單純給予HAART治療，觀察周期為12個月。觀察治療前后患者CD3T，CD4T，CD8T，CD4CD8比值，卡氏積分，病毒載量。于實驗結(jié)束后采用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果經(jīng)過12個月的治療，結(jié)果如下①在改善中醫(yī)證候方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組總有效率7105，單純HAART組總有效率4473，益艾康膠囊在改善患者中醫(yī)證候方面發(fā)揮重要作用。②中醫(yī)證候積分方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組中醫(yī)證候積分下降較明顯，而單純HAART組中醫(yī)證候積分改善不明顯。③體重方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組治療前后體重增加較單純HAART組治療前后體重無統(tǒng)計學意義。④卡氏積分變化兩組均可改善患者卡式積分，但益艾康膠囊聯(lián)合HAART效果要優(yōu)于單純HAART治療組。⑤CD3T淋巴細胞計數(shù)組間比較治療前兩組無差異。而組內(nèi)比較益艾康膠囊聯(lián)合HAART組治療前后CD3T淋巴細胞計數(shù)有顯著統(tǒng)計學意義，而單純HAART治療組治療前后無統(tǒng)計學意義。⑥CD4T淋巴細胞計數(shù)益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD4T淋巴細胞計數(shù)。⑦CD8T淋巴細胞計數(shù)益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD8T淋巴細胞計數(shù)。⑧CD4CD8比值益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD4CD8比值。⑨病毒載量變化治療前后益艾康膠囊聯(lián)合HAART組和單純HAART組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。⑩益艾康膠囊具備良好的安全性。結(jié)論根據(jù)研究結(jié)果提示益艾康膠囊主要通過改善癥狀和體征，提高CD4T數(shù)量及CD4CD8比值，降低CD8T淋巴細胞數(shù)量，卡氏積分明顯，大大改善了病人的生活質(zhì)量。因此，可以看出在益艾康膠囊在改善患者的生活質(zhì)量方面發(fā)揮著重要作用。益艾康膠囊聯(lián)合抗病毒治療可以延緩艾滋病患者的進程，提高患者生存質(zhì)量，延長其生存期。

簡介：目的構(gòu)建人單純皰疹病毒1型HERPESSIMPLEXVIRUSHSV1綠色熒光蛋白GREENFLUESCENTPROTEINGFP真核表達系統(tǒng)用于HSV感染的快速診斷方法提取HSV1DNA利用DNASTAR軟件設計對應于HSV1SM44株ICP6啟動子的PCR引物引入BAMHI和HINDⅢ酶切位點PCR擴增目的基因片段將回收純化的PCR產(chǎn)物連接至PMD18T載體構(gòu)建亞克隆切下目的基因連接至真核表達載體PEGFP1構(gòu)建重組質(zhì)粒PICP6EGFP經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定后以陽離子脂質(zhì)體法LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染VERO細胞轉(zhuǎn)染48H后加入G418400ΜGML篩選陽性細胞克隆進行放大培養(yǎng)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株VEROICP6EGFP細胞以不同量的HSV1感染VEROICP6EGFP細胞分別于感染后6H、8H、10H以倒置熒光顯微鏡檢測GFP熒光于感染后15H以流式細胞術(shù)測定GFP熒光的量和強度同時以人巨細胞病毒和柯薩奇病毒檢測VEROICP6EGFP細胞誘導表達的特異性結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得441BP大小的目的基因片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒PICP6EGFP經(jīng)雙酶切及DNA測序鑒定表明重組正確重組質(zhì)粒PICP6EGFP轉(zhuǎn)染VERO細胞后以G418篩選11天出現(xiàn)陽性細胞克隆建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株VEROICP6EGFP細胞經(jīng)HSV1誘導感染最早于6H即可在倒置熒光顯微鏡下檢測到GFP綠色熒光隨著時間的增加GFP熒光的量及強度逐漸增加流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明GFP熒光的量及強度隨HSV1病毒的滴度增加而增加人巨細胞病毒和柯薩奇病毒感染VEROICP6EGFP細胞后6H、10H及24H均未檢測到特異性熒光出現(xiàn)結(jié)論該研究建立的人單純皰疹病毒1型綠色熒光蛋白真核表達系統(tǒng)具有早期、快速、靈敏等優(yōu)點特異性較高進一步完善后有望用于HSV1感染的診斷以及抗病毒藥物的篩選

簡介：背景和目的丙型肝炎病毒核酸HCVRNA檢測缺乏統(tǒng)一的定量標準，給臨床的診斷和治療帶來了很多問題。研制國內(nèi)用于HCVRNA擴增檢測的血清標準物質(zhì)，推進核酸檢測的標準化。構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，表達內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶RNASE特性。替代凍干血清的標準品，使其具有更好的臨床適用性。方法1、選擇HCV陽性血漿，用熒光定量PCR檢測試劑進行初步檢測，再用陰性的獻血員血漿，除纖維蛋白原纖原后進行稀釋。采用國際公認的PCR內(nèi)標定量方法，即ROCHE公司COBASAMPLIC及相應試劑進行檢測，以WHO標準品NIBSC編號96790進行比對定值。2、將該定值制備物發(fā)放給HCVRNA熒光定量試劑的生產(chǎn)廠家進行檢測。3、由于HCV分型和HCVRNA定量檢測試劑盒，所檢測的區(qū)域主要集中在5UTR區(qū)，因此本研究擬選用5UTR區(qū)作為MS2噬菌體的包裝序列。引物5端引入HINDⅢ酶切位點。PCR產(chǎn)物進行T載體克隆后用限制性內(nèi)切酶HINDⅢ酶切獲得所需要的目的片段，與用HINDⅢ酶切的表達載體PNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達載體PNCCL1HCV。在IPTG誘導下，衣殼蛋白會在攜帶有PETMS2HCV的細菌中表達，并與RERNA組裝成病毒樣顆粒。誘導后的細菌經(jīng)超聲碎菌，離心后即可得到含病毒樣顆粒的上清。為驗證包裝的核酸為HCVRERNA，取20ΜL上清按1∶10至1∶106比例稀釋后，依照異硫氰酸胍鹽提取RNA的方法提取VLPS的RNA，然后進行RTPCR。取20ΜL所得到的上清，加入RNASEA100U和DNASEI20U，37℃溫育4天以觀察病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。將病毒樣顆粒用PEG6000沉淀后，加入正常人陰性血清，取20ΜL于45℃放置3天觀察病毒樣顆粒是否適合運輸。結(jié)論第一部分研究獲得的定值凍干血清是我國第一個用于核酸檢測的標準品。由于該標準物質(zhì)基質(zhì)為凍干血清，含有完整的病毒核酸序列，與臨床檢測的病人標本一致，具有很好的臨床適用性。推廣范圍包括各個HCVRNA檢測試劑生產(chǎn)廠家、醫(yī)院臨床基因擴增檢驗實驗室及進行核酸篩查的血站等。該標準物質(zhì)，在國內(nèi)主要PCR檢測試劑的生產(chǎn)廠家均得到了應用，在穩(wěn)定性及定值的準確性方面得到了充分肯定。由該標準物質(zhì)傳遞的血清基質(zhì)的標準曲線，由于血清基質(zhì)的標準曲線同待測樣本一樣經(jīng)過純化和逆轉(zhuǎn)錄步驟，消除了標準品與樣本間提取效率和逆轉(zhuǎn)錄效率檢測差異，同時消除了不同試劑不同人員操作間的差異，又具有溯源性，使檢測結(jié)果準確并具有可比性，因此該標準物質(zhì)在臨床基因擴增定量檢測HCVRNA方面有廣闊的應用前景，將有力的促進臨床HBVDNA和HCVRNA定量檢測的標準化。第二部分研究得到的表達載體PETMS2HCV及原核表達系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNASE的HCVRNA標準品和質(zhì)控品的平臺。獲得了HCV1B、2A、6A型三種基因型病毒樣顆粒。該病毒樣顆?？梢灾苯幼鳛樽鳛閮龈裳鍢藴饰镔|(zhì)的替代品，也可以做HCV核酸測定中的陽性質(zhì)控物和某些HIVRNA外標定量測定的外標定量標準；還可以為HCVRTPCR檢測試劑盒和實驗室室問質(zhì)量評價提供無生物傳染危險性的樣本。如果對PETMS2HCV中的HCV檢測的目的片段進行缺失、插入和突變等修飾，所獲得的病毒樣顆?？梢宰鳛镠CV定量測定中的內(nèi)標標準和HCVRTPCR測定的內(nèi)標質(zhì)控物。

簡介：VIF（VIRALINFECTIVITYFACT）是HIV1自身編碼的附屬蛋白之一，在HIV1復制過程中起著重要作用。最近，對VIF的研究揭示了固有免疫的新成員APOBEC3G、APOBEC3F，是一種抑制HIV1感染的細胞內(nèi)蛋白，也是一種胞苷脫氨酶，在病毒復制末期被整合進子代病毒粒子，繼而引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄病毒CDNA負鏈產(chǎn)生大量的DCDU突變，能致死性突變反轉(zhuǎn)錄病毒和反轉(zhuǎn)錄元件。研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3G和APOBEC3F為APOBEC家族成員，位于人類染色體22Q12Q13，二者均能介導固有免疫，對病毒尤其是對逆轉(zhuǎn)錄病毒具廣譜抗病毒效應，其中，APOBEC3G對HBV具有強烈的抑制作用，國外腫瘤實驗表明，APOBEC3G抑制MLV效果顯著，抑制HBV復制明顯優(yōu)于抗病毒藥物3TC，并可使對照中的HBVDNA至少下降50倍。與APOBEC3G一樣，APOBEC3F也具有DNA編輯功能，可與APOBEC3G共表達，一起抵抗病毒侵入。新近研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3G和APOBEC3F為人體細胞表達的兩種胞苷脫氨酶，二者對病毒表達的VIF均存在重要拮抗關(guān)系。VIF是HIV自身基因組VIF基因表達的一種重要病毒感染因子，與病毒感染密切相關(guān)。機體APOBEC3G和APOBEC3F過量表達，可有效抵抗病毒VIF的功能行使，此一現(xiàn)象對VIF缺陷株病毒（VIF）失去感染性尤為顯著。APOBEC3G、APOBEC3F與HIV病毒VIF之間存在的這一拮抗關(guān)系為艾滋?。ˋCQUIREDIMMUNEDEFICIENCYSYNDROME，AIDS）治療帶來了新的希望和曙光。以APOBEC3G和APOBEC3F作新藥靶點，研究開發(fā)相關(guān)蛋白藥物或生物制劑，對于艾滋病及其它逆轉(zhuǎn)錄病毒病防治無疑具有非常重要的意義。目前，從生物信息學角度研究分析APOBEC3G和APOBEC3F基因的文獻不多，國內(nèi)除王翌等對APOBEC3G基因曾作過一些粗略分析外，APOBEC3F基因研究文獻鮮見報道。本研究在開展對APOBEC3F基因生物信息學研究的同時，結(jié)合分子生物學實驗嘗試APOBEC3G基因提取和分析，以期從生物信息學和分子生物學角度揭示和闡述APOBEC3G、APOBEC3F與病毒VIF之間的相互作用關(guān)系。在APOBEC3F基因生物信息學分析中，作者在基因水平分析了APOBEC3F基因特性；在蛋白質(zhì)水平對其二級結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋以及細胞定位等進行了預測；運用基因庫大量EST序列，通過電子克隆獲得了豬APOBEC3F的全基因序列，并進行了相關(guān)分析。

簡介：乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV是一種部分雙鏈環(huán)狀嗜肝DNA病毒，宿主范圍狹窄，主要是靈長類中的人類和大猩猩。HBV在人類可引起急、慢性乙型肝炎、肝纖維化、并與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Α干擾素LNTERFERONΑ，IFNΑ仍是目前最常用的治療乙型肝炎病毒感染的藥物。它通過建立細胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約23的患者表現(xiàn)為對Α干擾素治療無反應，即沒有出現(xiàn)HBEAG血清轉(zhuǎn)換和血清HBVDNA水平降低，除了宿主因素外還與病毒本身抗干擾素作用有關(guān)。目前比較明確的是HBVDNA聚合酶的抗干擾素作用。FOSTER等發(fā)現(xiàn)，表達HBVDNA聚合酶末端蛋白可顯著抑制細胞對Α干擾素反應，并認為是由于TP表達阻斷Α干擾素通路引起，但其抗IFNΑ作用的功能區(qū)域迄今尚不清楚。中國地區(qū)HBV感染主要為B基因型及C基因型，臨床資料顯示，B基因型HBV感染對干擾素治療的反應好于C基因型，我們通過對大樣本HBVDNA聚合酶區(qū)氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，B、C基因型HBVDNA聚合酶在TP區(qū)及SPACER區(qū)分別存在14及44個氨基酸差異，目前尚不清楚這些氨基酸差異是否與B、C基因型HBV感染對干擾素治療反應差異有關(guān)。另TP位于DNA聚合酶的氨基端，通常情況下只能以DNA聚合酶的形式出現(xiàn)，并不存在單獨游離的TP。但隨著擴增HBV全基因組DNA方法的建立，在乙肝患者中分離到多種HBV基因組剪接變異體、缺失突變體。其中在2309NT以后發(fā)生剪接和缺失的HBV亞基因組DNA能編碼TP相關(guān)蛋白HBVDNA聚合酶的編碼區(qū)起始于2309NT。對于這些剪接和缺失的HBV亞基因組DNA及其編碼的各種TP相關(guān)蛋白的抗干擾素作用還未有過系統(tǒng)研究。為此，本研究內(nèi)容包括三部分一乙型肝炎病毒TPSPACER抗干擾素作用功能區(qū)域分析以HBV全基因組DNA重組質(zhì)粒FMU013為模板，PCR擴增獲得DNA聚合酶TPSPACER區(qū)各功能區(qū)基因片段，克隆到真核表達載體PCDNA31HISC中，構(gòu)建各功能區(qū)缺失突變體，與干擾素反應報告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，確定抗IFNΑ反應的功能區(qū)域。二比較B、C基因型TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的強弱收集干擾素治療有反應、無反應慢性乙型肝炎患者治療前血清，抽提血清DNA，以限制性片段長度多態(tài)性方法確定基因型。PCR獲得各B、C基因型標本TPSPACER區(qū)N端257AA基因片段，克隆到真核表達載體PCDNA31HISC中。各重組表達載體與干擾素反應報告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，比較B、C基因型TPSPACER區(qū)抗干擾素作用差別三乙型肝炎病毒剪接變異缺失突變體編碼的TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用收集中、重度慢性乙型肝炎患者血清，抽提血清DNA，PCR擴增HBV基因組DNA克隆到PUC18載體中并測序。與標準株HBV序列進行相似性比較，分析其結(jié)構(gòu)，找出符合本研究的所有可能存在的剪接變異類型在2309NT以后發(fā)生剪接和各種缺失突變體在2309NT以后發(fā)生缺失，克隆各剪接變異體和缺失突變所編碼的TP相關(guān)蛋白基因到真核表達載體PCDNA31HISC中，各TP相關(guān)蛋白基因重組載體與干擾素反應報告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，確定各TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用并分析其發(fā)揮抗干擾素作用的功能區(qū)域。本研究確定了TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的功能區(qū)域與SPACER區(qū)密切相關(guān)，且其發(fā)揮作用需要完整的TP區(qū)；B基因型HBV感染對干擾素治療的反應性顯著好于C基因型HBV感染，但這種差異與HBVTPSPACER區(qū)抗干擾素作用無關(guān)。分離獲得了8種剪接變異體、5種缺失突變體，證實其編碼的兩種TP相關(guān)蛋白具有抗干擾素作用，TPSPACER是其發(fā)揮作用的功能區(qū)。

簡介：中國醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學位論文是我本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構(gòu)的學位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關(guān)責任。論文作者簽名壟重至釜日期翌二￡二至L中國醫(yī)科大學研究生學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學有關(guān)保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大學。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科大學，且導師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學。學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導教師簽名日期中文論著摘要腺病毒介導的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子二步轉(zhuǎn)錄增強系統(tǒng)HTERTP．TSTA在卵巢癌中轉(zhuǎn)錄活性的研究研究背景卵巢上皮細胞癌目前仍是嚴重威脅廣大婦女健康的惡性腫瘤。尋求傳統(tǒng)手術(shù)、放化療之外的新的療法十分必要。在卵巢癌的生物治療中，基因治療備受矚目。已有愈來愈多的轉(zhuǎn)基因治療進入臨床研究。為了防止促凋亡基因?qū)φ＜毎亩拘宰饔?，實現(xiàn)治療基因在腫瘤組織中的靶向表達十分必要。應用腫瘤特異性啟動子TUMORSPECIFICPROMOTER,TSP對治療基因進行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，再通過對病毒包膜基因進行修飾，改變病毒對細胞的CAR嗜性為整合素嗜性，來提高病毒對卵巢癌細胞的感染水平，是行之有效的方法之一。研究目的檢測HTERT啟動子轉(zhuǎn)錄增強系統(tǒng)TSTA．HTERTP在卵巢癌細胞及正常細胞中的轉(zhuǎn)錄活性。、研究方法應用AD．MAX系統(tǒng)將各重組腺病毒載體包裝成重組腺病毒并鑒定、純化及擴增。應用熒光顯微鏡檢測各啟動子系統(tǒng)調(diào)控下表達EGFP的重組腺病毒感染卵巢癌細胞系OVCAR3、H08910，SKOV3，宮頸癌細胞系HELA及正常人臍血內(nèi)皮細胞系ECV304后EGFP的表達情況，應用CCK．8試劑可簡便而準確的進行細胞增殖和毒性分析，并應用流式細胞術(shù)的熒光激活細胞分類器FLUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTER,FACS對感染的不同細胞進行熒光定量檢測，檢測細胞的發(fā)光強度。研究結(jié)果1、載體構(gòu)建與病毒制備成功制備RGD修飾型腺病毒載體CTD010．1及

簡介：A型流感病毒屬于正粘病毒科單股負鏈的RNA病毒。由于其宿主廣泛、傳染性強、傳播速度快短時間內(nèi)可造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球范圍的流行。自19世紀以來已爆發(fā)四次全球性的流感大流行其中1918年爆發(fā)的“西班牙流感H1N1”大流行最為嚴重造成全世界近5000萬人死亡給人類健康和全球經(jīng)濟帶來了極大的危害。目前針對A型流感病毒感染的預防和治療措施主要是采用離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑等抗病毒藥物但是這些藥物對于人體神經(jīng)系統(tǒng)均有一定的副作用而且由于A型流感病毒基因變異快隨著藥物的大量使用極易產(chǎn)生耐藥性毒株。因此進行流感病毒治療藥物及抗病毒靶標研究迫在眉睫。微小RNAMIRNA是長度約22NT的非編碼單鏈小RNA分子廣泛存在于真核生物基因組中其基因位置及序列都十分保守。MIRNA主要通過互補結(jié)合到靶標MRNA上而起到轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控的作用參與許多細胞過程包括細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。目前已有研究表明宿主MIRNA在乙肝病毒、丙肝病毒及人類免疫缺陷病毒等多種病毒感染中通過對宿主或病毒的基因表達進行調(diào)控從而影響病毒復制、侵染及致病等過程。此外由于MIRNA的作用途徑專一且效果明顯MIRNA及其靶點已成為治療病毒性疾病特效基因藥物的研究熱點。A型流感病毒基因組由8個節(jié)段組成前三個節(jié)段編碼聚合酶蛋白PB2、PB1和PA三者共同組成RNA依賴的RNA聚合酶蛋白復合體。第五個節(jié)段編碼核蛋白NP包裹著病毒的核酸起保護作用。在流感病毒復制過程中NP、病毒RNA及三個聚合酶蛋白共同組成核糖核蛋白復合體RNPS不僅參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯還在病毒RNA及蛋白的入核、出核及胞質(zhì)聚集過程中發(fā)揮著重要的功能。這四個基因節(jié)段不僅功能重要而且存在很多保守位點因此針對以上基因?qū)ふ倚碌乃幬锇形谎兄品€(wěn)定的抗流感病毒藥物具有舉足輕重的作用。本研究以流感病毒聚合酶蛋白基因和核蛋白基因為靶點尋找廣譜調(diào)控A型流感病毒復制的宿主MIRNA并確定MIRNA的靶位點為宿主抗病毒防御機制提供更深層次的理解也為應用生物信息學方法來開發(fā)廣譜抗流感病毒的基因藥物及尋找新抗病毒靶點奠定基礎。本研究首先利用生物信息學方法預測并篩選廣譜靶向A型流感病毒復制相關(guān)基因的宿主MIRNA。我們以MIRNA靶標預測軟件MIRA為主體設計了廣譜靶向A型流感病毒基因的宿主MIRNA的預測篩選流程。采用PERL語言編程從MIRA軟件輸出結(jié)果中提取有用信息并通過設定嚴格的軟件參數(shù)制定詳盡的篩選原則使篩選出的MIRNA兼具廣譜靶向率高與抑制病毒復制效果好等優(yōu)點。針對PB2基因挑選了MIR1883P和MIR345針對PB1基因挑選了MIR3183針對PA基因挑選了MIR15A和MIR99B針對NP基因挑選了MIR7693P篩選的6個MIRNA對A型流感病毒的廣譜靶向率分別為813％95X7?1D4和953。隨后從季節(jié)性流感病毒AFM147H1N1毒株中擴增PB1、PB2、PA及NP基因全長并構(gòu)入T載體中通過測序獲得了該毒株的基因序列MIRA軟件預測結(jié)果顯示所篩選的6個MIRNA在該毒株上均具有良好的靶向性堿基對匹配結(jié)合模式具有代表性可以利用該毒株進行MIRNA的功能驗證。采用一系列實驗方法逐步驗證MIRNA抑制A型流感病毒復制的效果。1首先采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行初步篩選根據(jù)MIRNA的熒光抑制率判定MIRNA與潛在靶標的結(jié)合能力。結(jié)果顯示生物信息學篩選出的6條MIRNA與潛在靶標均有一定的結(jié)合能力但是靶向于PA基因的MIR15A和MIR99B熒光抑制率較小僅為2882和2075其余4條MIRNA與潛在靶標結(jié)合能力較強MIR1883P和MIR345可靶向結(jié)合PB2基因MIR3183可靶向結(jié)合PB1基因三者熒光抑制率均達到45左右。MIR7693P可靶向結(jié)合NP基因熒光抑制率為365。2進一步驗證MIRNA對A型流感病毒蛋白表達的影響。首先構(gòu)建了表達PB1、PB2、PA及NP蛋白基因的真核表達載體并與人工合成的MIRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。WESTERN印跡結(jié)果顯示4條MIRNA均可顯著抑制相應病毒蛋白的表達。其中MIR7693P對NP蛋白表達的抑制效果最為顯著。MIR1883P和MIR345對PB2蛋白表達的抑制效果、MIR3183對PB1蛋白表達的抑制效果與陽性對照MIRNAMIR491對靶標蛋白PB1蛋白表達的抑制效果基本一致。3最后觀察MIRNA對A型流感病毒復制的抑制效果。首先驗證了季節(jié)性流感病毒AFM147H1N1毒株在MDCK細胞系及A549細胞系上的復制動力學特性繪制了一步生長曲線確定了病毒最佳接毒劑量隨后利用最佳病毒感染劑量進行了MIRNA抑制流感病毒復制實驗。實驗結(jié)果表明MIR1883P可顯著抑制A型流感病毒在A549細胞上的復制與對照組相比病毒感染后48H病毒滴度降低08個TCID50。MIR345效果其次可使病毒感染后48H病毒滴度降低051個TCID50。二者均優(yōu)于陽性對照MIR491其僅使病毒感染后48H病毒滴度降低043個TCID50。基于以上研究我們通過生物信息學預測及一系列實驗驗證最終篩選到一個MIRNA即MIR1883P可廣譜靶向結(jié)合A型流感病毒PB2基因抑制PB2蛋白表達顯著抑制A型流感病毒的復制。不僅如此我們通過生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)MIR1883P對近期爆發(fā)的人感染H7N9禽流感病毒PB2基因也具有很好的靶向性而且其靶向效果優(yōu)于AFM147H1N1毒株。本研究的成果為宿主抗流感病毒防御機制提供了更深層次的理解同時提出了一種廣譜靶向抑制流感病毒的MIRNA篩選方法為應用生物信息學方法來挖掘抗A型流感病毒的MIRNA基因藥物的研究奠定了理論基礎。

簡介：點擊查看更多小柴胡湯及其拆方抗流感病毒作用的體外實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：該研究以13例接受IFN治療而應答效果不一的慢性丙型肝炎病人為研究對象分別留取IFN治療前后的血清通過逆轉(zhuǎn)錄套式PCR擴增HCVNS5A區(qū)并對PCR產(chǎn)物進行克隆克隆后的PCR產(chǎn)物在同一凝膠上進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP分析和異質(zhì)性雙鏈HD分析篩選其準種QUASISPECIES以準種的多少代表基因的復雜性對治療前后的優(yōu)勢準種測序并與HCV1B前基因型HCVJ序列比較結(jié)果顯示HCVNS5A準種的多少與IFN的應答呈負相關(guān)IFN完全應答組和部份應答組病人治療前準種數(shù)明顯少于無應答組P005

簡介：目的在持續(xù)急性鴨乙型肝炎病毒感染模型的基礎上，觀察中藥復方茵陳蒿湯對鴨血清DHBVDNA、DHBSAG的影響，以探索茵陳蒿湯抗肝損傷退黃的療效機制。方法購健康成年武漢麻鴨100只，利用DHBSAGELISA檢測及DHBVDNA斑點雜交方法選用DHBVDNA、DHBSAG均陰性的武漢麻鴨60只作為實驗對象，分別經(jīng)翼下靜脈注射10ML乙肝病毒強陽性血清，7天接種一次，共接種4次，建立穩(wěn)定持續(xù)的乙型肝炎病毒急性感染模型。而后將60只鴨隨機分為3組，每組20只，每組分別給予茵陳蒿湯、拉米夫定灌胃治療及生理鹽水對照觀察，共治療30天，觀察用藥前后以及治療組與對照組的DHBVDNA、DHBSAG的變化情況。結(jié)果對照組實驗鴨DHBVDNA、DHBSAG30天內(nèi)始終維持陽性，并且滴度無顯著變化。兩治療組DHBVDNA滴度在第15天均有所降低，但下降程度并未達顯著性意義；30天后兩治療組DHBVDNA滴度與用藥前比較顯著降低P＜005，與對照組比較亦顯著降低P＜005，其中拉米夫定組DHBVDNA含量的下降比茵陳蒿湯組更為明顯，二者差異有顯著意義P＜005。提示茵陳蒿湯與拉米夫定對DHBVDNA復制均有抑制作用，其中拉米夫定的抑制作用強于茵陳蒿湯。用藥30天后茵陳蒿湯組DHBSAG的滴度下降與用藥前相比有顯著差異P＜005，與對照組也有顯著性差異P＜005；拉米夫定組治療30天后DHBSAG的滴度雖有所下降，但與治療前相比沒有顯著性差異，與對照組DHBSAG的滴度相比，差異亦不明顯。提示茵陳蒿湯對DHBSAG在體內(nèi)的表達合成具有抑制作用，但拉米夫定對此則沒有明顯作用。結(jié)論茵陳蒿湯對鴨乙肝病毒持續(xù)感染造成的急性損傷不僅具有直接減輕肝損傷的作用，而且對鴨乙肝病毒還具有直接抑制作用，其作用通過抑制DHBVDNA的復制及DHBSAG蛋白的表達途徑來達成。顯然，茵陳蒿湯的作用是多靶位的，綜合性的。

簡介：點擊查看更多肌注重組腺相關(guān)病毒基因治療血友病B的安全性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：20143SKBR3HER2

簡介：上海第二醫(yī)科大學碩士學位論文人巨細胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測方法的建立姓名孫立山申請學位級別碩士專業(yè)臨床檢驗診斷學（免疫學測定）指導教師周文達20050401人巨細胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測方法的建立中文摘要人巨細胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測方法的建立中文摘要人巨細胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV也稱人皰疹病毒5型HUMANHERPESVIMS5，HHVS屬B皰疹病毒亞科。人巨細胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多數(shù)臨床上呈不顯性感染或潛伏感染，多數(shù)人在兒童或青少年期受HCMV感染后獲得免疫。對于孕婦，原發(fā)感染或新的HCMV復發(fā)感染可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍生期感染，可致感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累、多器官損害、智力低下或耳聾等；在正常健康人中可引起單核細胞增多癥；在免疫狀態(tài)低下的人群器官移植受者、艾滋病患者、癌癥患者及放射損傷患者等中，HCMV可引起嚴重的感染，甚或致死。鑒于HCMV在臨床疾病中的重要作用，已經(jīng)引起醫(yī)學界的廣泛重視。巨細胞病毒感染的實驗室檢測有多種方法，除了病毒的分離，還包括抗體檢測、抗原檢測、病毒核酸檢測DNA、RNA等方法。傳統(tǒng)的人巨細胞病毒特異性抗體的檢測多是以病毒裂解物為抗原，此類抗原存在很多缺點①由很多病毒抗原組成，所含抗原表位不確定，很難標準化②需要在成纖維細胞中進行病毒培養(yǎng)，會導致潛在細胞蛋白的污染。由于器官移植受者可能會產(chǎn)生暫時性自身抗體反應，而細胞蛋白的污染可能會導致HCMV抗體檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性；③與皰疹病毒科的其它病毒感染所產(chǎn)生的抗體存在交叉反應。為了提高HCMV抗體檢測的敏感度和特異性，本研究根據(jù)HCMV強抗原性表位，擬以固相多肽合成方法合成HCMV抗原性肽段，并以此多肽為抗原建立對HCMV特異性抗體檢測的ELISA方法。根據(jù)國外對HCMV抗原性表位的研究，我們選擇了病毒蛋白PPL50、GB、PP52、PP28及13965的7個強抗原性表位。以匿相多肽合成技術(shù)SOLID曲ASCPOLYPEPTIDESYNTHESISSPPS，以FMOCGLYWANG樹脂為固相載體，以NQFMOC基團保護的氨基酸為原料，以TBTU／HOBT作為偶聯(lián)試劑／活化劑，經(jīng)過脫保護洗滌縮合一洗滌循環(huán)的合成的路線，從C端一N端順序依次偶聯(lián)氨基酸，直至合成所需的肽段。然后將多肽從樹脂上裂解下來，洗滌，凍干，得到粗肽。所得粗肽再經(jīng)過離子交換層析和反相高效液相色譜純化，最終得到純度95％的抗原肽。應用棋盤滴定實驗確定了抗原肽的最佳包被濃度、最佳包被用緩沖液等最適實驗條件。并以所合成的7段肽分別包被96微孔板，以間接ELISA方法，對所